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植物组织培养实验中的常见问题 植物组织培养起源于haberlandt（1902）的工作，已有100多年的历史。广义的组织培养不仅包括在无菌条件下利用人工培养基对植物组织的培养,而且包括对原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养。现在植物组织培养技术已在科研和生产中广泛应用,成为最常用的生物技术之一。虽然植物组织培养的操作过程并不复杂,但在实验和生产过程中常常会遇到一些问题,重者会导致实验和生产的失败,给科研和生产造成损失。 针对植物组织培养过程中出现的几个问题进行分析,并提出实验改进方法。 1 培养基母溶液的制备 MS培养基是组织培养中常用的培养基,下面以MS培养基为例,简述其母液配制过程常出现的问题及改进方法。 1.1 hp2-ro1最佳沉淀液的配制 大量元素中的Ca2+与SO42-和HPO42-容易生成CaSO4、CaHPO2沉淀。改进方法是把其中的Ca2+ 单独配制成一个贮备液,而把其它的大量元素配制成另一个贮备液。 考虑到大量元素的溶解及使用方便,通常配制成20倍母液。例如配制1 000 mL培养基,只需取50 mL大量元素母液。 1.2 制备纳米母溶液 1.2.1 抗菌材料的溶解 在配制微量元素母液时常常出现加人钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)后,钼酸钠难溶解,即使通过加热也无法解决。较好的方法是先用室温下的蒸馏水单独溶解后再倒人微量元素母液内。 1.2.2 母液的配制 微量元素的用量极微。特别是其中的硫酸铜(CuSO4·2H2O)和氯化钴(CoCl2· 6H2O)按配制100倍母液计算,配制1 000 mL的母液仅需分别称取5 mg。若没有分析天平或分析天平的称量误差较大很难准确称取,解决的方法是分别称取50 mg溶解于少量的水,再加水定容至100 mL后,用移液管准确吸10 mL。 1.2.3 铁盐的结晶 MS配方中的铁盐是EDTA螯合铁,它是由硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)与乙二胺四乙酸钠(Na2-EDTA· 2H2O)螯合而成。新配制的螯合铁颜色为淡黄色,贮存一段时间颜色会加深但无结晶析出,不影响它的质量。如果刚配制的铁盐放入冰箱后出现结晶,可能的原因有:配制螯合铁时,没有使FeSO4与Na2-EDTA完全螯合,此时如果将其放人冰箱保存,由于温度降低,FeSO4和Na2-EDTA就会结晶析出。 配制EDTA螯合铁的改进方法:将FeSO2和Na2-EDTA按1 000 mL母液的用量准确称取后分别置于盛有500 mL蒸馏水的烧杯中,加热并不断搅拌使之溶解,然后一边加热一边把FeSO4溶液慢慢倒入Na2-EDTA溶液中并不断搅拌直至溶液接近沸腾,停止加热,待溶液冷却后倒入试剂瓶,放入冰箱保存。 2 高压灭菌锅内空气 手提式、卧式高压蒸气灭菌锅是组培工作中最常用的灭菌装置。水蒸气的温度随其所受压力的增加而升高,因而灭菌用的高温蒸气都是通过加压获得,而空气的热胀系数比水蒸气大,如果灭菌锅内的空气没排除或排除不完全,那么,即使灭菌锅的压力表反映出锅内的压强单位,有空气存在下灭菌锅内也无法达到灭菌所需的温度。 有实验显示若锅内的空气只排除一半,压力表指针达到0.105 MPa时。锅内的实际温度仅能达到112℃,比要求的121℃低9℃,导致灭菌不彻底,可能造成培养基的大量污染。所以,高压灭菌锅的使用中,关键是设法排除锅内空气。 常用的排除灭菌锅内空气的方法是,先关放气阀,待锅内压强升到0.05 MPa时,打开放气阀排出空气,当排放至压力表指针为零时再关闭,继续加温直到锅内压强达到灭菌规定时开始计时,按不同灭菌材料,维持一定时间。 组培培养基的灭菌要求是在0.105 MPa、维持15~20 min。按照这种要求给培养基灭菌时,常发生有个别培养基灭菌不彻底。原因可能在于一次排空气法仍无法排除锅内的空气。采用二次排气法对培养基灭菌。经过多年的实践证明,未发生过培养基灭菌不彻底的现象。 高压蒸气灭菌锅二次排气灭菌法的做法是:先按常规第一次排气后,继续加热,当压力表再一次升到0.05 MPa时,再排一次锅内的空气,之后的操作与常规法相同。 3 关键技术的应用 无菌操作技术直接关系到组培材料及培养基的杂菌污染率,是组织培养过程的关键技术之一。若无菌操作技术不规范或操作技术不熟练都可能引起刚接种的外植体或组织苗大面积污染,为减少组织苗的污染率,对无菌操作过程的某些环节作了改进,既提高了工作效率,又减少了污染率。 3.1 每次接种时只有一个无菌的铝盘 3.1.1 酒精研磨后再加入酒精灯上烧 组织培养中外植体、愈伤组织、丛生芽及出根苗的分切皆要使用培养皿,一般的做法使用一个小培养皿,接种每一瓶组织苗之前用70%~75%的酒精擦拭后再放到酒精灯上灼烧,这种做法容易产生下面两种情况。 (1)灭菌不彻底,容易形成交叉污染,即某一瓶组织苗污染后通过