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适宜用微生物种群为原料的益生菌添加工艺研究 双歧菌和嗜酸性菌的生理功能包括调节肠道菌群、减少胆固醇、肿瘤、免疫、合成维生素和其他生理功能。它们是微生态食品中的常见活性物质。添加益生菌类产品的关键问题是保持其在产品加工后和产品保存期间有足够的活菌起生理作用。双歧杆菌和嗜酸乳杆菌在产品的储存期间活菌数均呈下降趋势，但不同厂家的产品、不同菌株，下降的程度是不同的。通过本实验筛选出适宜用在婴幼儿配方奶粉中的益生菌菌株，并确定最佳添加工艺。 1 材料和方法 1.1 材料和设备 1.1.1 益生菌科汉森、图4、4 婴幼儿配方奶粉（黑龙江省完达山乳业股份有限公司）；益生菌（科·汉森、丹尼斯克、利统、弗蒙特）；培养基（TPY、MRS、BBL、BL）。 1.1.2 主要实验设备 厌氧培养箱；干混机；水分活度仪；无菌超净工作台。 1.2 方法 1.2.1 培养基上菌落数的确定 将待测样品作系列稀释，选择合适稀释度的稀释液接种到培养基上。为了确保平板计数时菌落数在30～300之间，可根据各公司提供的活菌数量级来确定适宜的稀释度。吸取0.1mL菌液均匀涂布至平皿中，培养后计数。 1.2.2 计算活细菌数的公式为 活菌数（个/g）=培养皿菌落数×稀释倍数×10 1.2.3 d活菌检测 按照无菌操作的要求，将每种菌株以适当比例与婴幼儿配方奶粉进行干混，分装到包装袋中，密封后，置于37℃，湿度为75%的恒温、恒湿培养箱中保存，每隔3天进行1次活菌检测。保存时间为1个月，并作数据记录。当保存期间活菌降低幅度过大时，应舍弃不再继续使用。以此检测结果为依据，选择在婴幼儿配方奶粉中存活率高的菌种作为原料。 1.2.4 工艺参数的范围的确定 单因素确定干混时的混料间温度、相对湿度、混料时间和基料水分活度的作用范围。 1.2.5 最佳操作参数的确定 在各参数作用范围内，取不同因素水平进行正交试验，从而确定最佳工艺参数。 1.2.6 湿培养箱中活菌测定 对样品进行加速实验，将样品置于37℃，相对湿度为75%的恒温、恒湿培养箱中保存，每隔3天进行1次活菌检测，保存时间为1个月，记录数据。观察保存期间不同工艺过程制得的产品中活菌数的变化情况，从而对益生菌添加工艺进行完善。经验数据表明，此保存条件相当于室温保存1年。 1.2.7 婴儿配方中的双螺线菌的检测 按GB/T 4789.34-2003食品卫生微生物学检验———双歧杆菌检验进行检测。 2 结果与讨论 2.1 菌种的存活率 在既定条件下进行保存，得到各单株菌的活菌数降落情况（见表1）。从表1中可以看出，由7株益生菌构成的婴幼儿配方奶粉加速保存期间，各菌种的活菌数均有很大变化，其中双歧B3、双歧B5、嗜酸La4和La5的菌数降低超过4个数量级，基本可认为其死亡率达100%，不再继续检测。双歧杆菌B2在保存期内存活率较高，能达到22.54%；嗜酸乳杆菌中只有La1存活率高，可达34.23%。由此可以看出，不同厂家提供的菌种在同样条件下进行保存时，其活菌数变化差别较大，其中双歧杆菌B2和嗜酸乳杆菌La1活菌存活率最高。考虑到双歧杆菌对婴儿的作用要好于嗜酸乳杆菌，所以确定以双歧杆菌为原料。 2.2 添加速率控制 2.2.1 新生儿配方奶粉添加工艺的确定 因为益生菌属于活性物质，对温度极其敏感, 并且婴幼儿配方奶粉在制粉过程中的受热温度达100℃以上, 所以不能采取湿法添加, 只能先制得婴幼儿配方奶粉基料, 然后再将益生菌干混其中。在干混过程中, 对益生菌活性有较大影响的因素包括:混料间温度、湿度、混料时间和基料水分活度。在同样的配方条件下, 利用单因素对每一因素的作用范围进行逐一确定, 产品在室温保存1周后, 检测其中的活菌数。以双歧杆菌在各种条件下的变化来确定产品的添加工艺。 (1) 混料间温度其它条件固定, 当混料间温度不同时, 试验结果如图1所示。从图中可以看出, 在温度低于22℃的条件下, 随着温度的降低, 所混样品中的活菌数基本没有变化。当温度高于28℃时, 混料间温度越高, 对益生菌在婴幼儿配方奶粉中的存活越不利。因此, 在婴幼儿配方奶粉中添加益生菌时, 混料间温度应控制在22～28℃。 (2）混料间相对湿度其它条件固定，当混料间相对湿度不同时，试验结果如图2所示。从图中可以看出，当湿度高于50%时，对益生菌的存活会产生影响，而且存在一定的线性关系。湿度越高，对菌种越不利。因此，在婴幼儿配方奶粉中添加益生菌时，混料间相对湿度应低于50%。 (3）混料时间其它条件固定，当混料时间不同时（也就是菌粉在空气中停留时间不同），试验结果如图3所示。从图中可以看出，当混料时间高于35min时，对益生菌的存活会产生影响，而且存在一定的线性关系。时间越长，对菌种越不利。因此，在婴幼儿配方奶粉中添加益生菌时，混料时间应低于30min