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egcg-bsa纳米粒的制备工艺与体外靶向性和活性评价 前列腺通常发生在中年。欧洲和美国的发病率其次是肺癌。我国前列腺前期癌的发病率达25%。表没食子儿茶素没食子酸(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶提取物中的主要多酚类有效成分,具有来源丰富、安全低毒和易溶于水的特点。近年研究表明,EGCG对前列腺癌细胞在体内外均具有显著的抑制效果,可能机制有诱导凋亡、周期阻滞、信号传导、抑制肿瘤侵袭和转移、抗氧化作用和抑制端粒酶活性等。适量的EGCG对人体无毒副作用,且对前列腺癌具有较强的抑制作用,但在体内能否高效的发挥抑瘤作用少有报道。 叶酸受体(folate receptor,FR)在正常组织中的表达高度保守,只在肺、肾、脉络膜和胎盘中有低至中等水平表达,且以β亚型为主。但在大部分恶性肿瘤中,如卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和鼻咽癌中均高度表达,有时可比正常组织高出100~300倍,这为叶酸(folate,folic acid,FA)介导药物靶向作用于肿瘤细胞的研究奠定了基础。牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)是一种安全无毒、无任何免疫原性、生物可降解的药物载体,对亲水性药物有较高的负载能力,是靶向药物传递系统研究的热点。因此,本文以叶酸偶联白蛋白纳米粒作载体,制备了EGCG白蛋白纳米粒(FA-EGCG-BSANP),并对其形状、粒径、靶向性和体外活性等方面进行了探讨。 ecgg-bsnp的制备 试剂与材料 叶酸(folate,FA,Sigma);N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,上海延长生化科技发展有限公司);二环己基碳二亚胺(DCC,上海延长生化科技发展有限公司);异硫氰酸荧光素(FITC,Sigma);EGCG(Sigma,纯度98%);白蛋白(BSA,Sigma);0.25%戊二醛溶液(天津光复精细化工研究所);二甲基亚砜(DMSO,Sigma,纯度99.5%);四甲基偶氮噻唑盐(MTT,Sigma);F12细胞培养液(F12 Nutrient Mixture[Ham],Gibco);优级胎牛血清(FBS,中国科学院天津灏洋生物);含EDTA胰蛋白酶(0.25%Trypsin0.02%EDTA,Gibco);前列腺癌细胞(PC-3,中国科学院上海细胞库)。 仪器 PicoplusⅡ原子力显微镜(MI,USA);Waters高效液相色谱仪(USA);UV-2550全波长分光光度计(Shimadzu);TE 2000-E激光共聚焦显微镜(Nikon);F-2500荧光分光光度计(Hitachi,Japan);Stat Fax-2100酶标仪(Awareness,USA)。 叶酸活性酯的制备称取叶酸1 g,超声溶于DMSO(20 mL,含三乙胺0.5 mL),20℃时搅拌下加入DCC 0.94 g和NHS 0.52 g,避光反应12 h,抽滤去除沉淀,余液加入2倍体积的乙醚并搅拌产生沉淀,抽滤,并用乙醚洗涤所得沉淀,干燥即为叶酸活性酯。 EGCG-BSANP制备 EGCG-BSANP制备步骤为:称取适量BSA和EGCG加蒸馏水溶解,室温搅拌下逐滴加入适量无水乙醇和0.25%戊二醛溶液,搅拌反应适当时间,离心,沉淀用等体积蒸馏水分散即得EGCG-BSANP混悬液。采用单因素法考察BSA质量浓度(10、20和30 mg·mL-1)、EGCG质量浓度(2.5、5、7.5和10 mg·mL-1)、无水乙醇用量(1、3、5和7倍蒸馏水量)、戊二醛用量(5、10、25、50和100μL)和反应时间(3、6、12和24 h)对EGCG-BSANP的平均粒径、成球率、载药量和包封率的影响,确定优化制备工艺。 FA-EGCG-BSANP制备 称取叶酸活性酯50mg,溶于DMSO 1 mL中。另取制备的EGCG-BSANP溶液2 mL,用1 mol·L-1Na2CO3/Na HCO3缓冲溶液调节pH 10。将二者混合搅拌反应45 min,离心,收集沉淀,最后用蒸馏水分散得FA-EGCG-BSANP混悬液。 FA-EGCG-BSANP的形状与粒径测定 取FA-EGCG-BSANP 20μL均匀分布于新解离的云母片上,自然风干,置于原子力显微镜下,观察其形状及粒径分布。 HPLC测定包封率和载药量 将制备的FA-EGCG-BSANP的混悬液冷冻干燥,取一定量的冻干粉用胰酶在37℃摇床内消化4 h,采用HPLC检测消化液中EGCG的含量,计算EGCG载药量和包封率。计算公式如下: EGCG标准曲线为:y=1×10-7x-0.021 9(y:EGCG质量浓度,mg·mL-1;x:峰面积),相关系数r2=0.999 2。包封率=WbsanpEGCG/WtotalEGCG×100