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四逆汤机械煎煮工艺的优化 四逆汤是“伤寒论”的经典方剂，由生附子、干姜和炒甘草（蜜炒）组成。具有加热和去寒回阳、救逆的功效。现代药理研究表明该方具有强心、抗休克、增加冠脉血流量的作用,是临床上常用的抗休克中药方剂之一。现代研究包括《中国药典》2010年版(一部)所收载四逆汤含量测定项下,多针对甘草中指标性成分含量进行考察,故本课题组前期利用HPLC建立与完善了可同时检测汤剂中苯甲酰新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚4种成分的质量控制方法。随着现代社会生活节奏的加快,机械煎煮使用频率不断增加,“代煎”现象在复方汤剂的临床应用中大量涌现。本文以汤剂中苯甲酰新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚4种成分含量为指标,通过单因素试验考察浸泡时间、煎煮时间、加水量、煎煮次数,同时设计L9(34)正交表进行四逆汤机械煎煮工艺优化试验,为有效控制汤剂质量、保证临床疗效提供实验基础。 1 药物、药品和试剂 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),AG285型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司),DHG-9240 A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司),TGL-16B离心机(上海安亭科学仪器厂),EPED-10TF型超纯水机(南京易普易达科技发展有限公司),YJX20/1+1型一体煎药机(北京东华原)。 苯甲酰新乌头原碱对照品(成都瑞芬斯生物科技有限公司,批号RFS-B-10-07-13),甘草苷、甘草酸铵、6-姜酚对照品均购于上海施丹德生物技术有限公司(批号分别为1321,1298,1263)。附子、炙甘草、干姜等药材均由南京海昌中药集团有限公司提供(批号分别为110217,110304,110224),经检验均符合《中国药典》2010年版(一部)相关项下要求;四氢呋喃、甲醇均为色谱纯,水为自制超纯水,其余试剂均为分析纯。 2 方法和结果 2.1 重量测定 2.1.1 生药量的确定 精密称取炙甘草6.0g、干姜9.0 g、附子15.0 g,煎煮制成每mL含生药量0.125 g的汤剂。精密吸取汤剂样品8 mL,离心(4 000 r·min-1,10 min),精密量取上清液2 mL,用甲醇定容至5 mL,充分混匀,0.45μm微孔滤膜过滤,备用。 2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取苯甲酰新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚对照品适量,用甲醇配制成苯甲酰新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚质量浓度分别为120,420,240,360 mg·L-1的混合对照品储备液,备用。 2.1.3 -四氢呋喃的合成 Thermo Hypersil BDS色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-四氢呋喃(25∶15,A)和0.1 mol·L-1醋酸铵水溶液(每1 000mL含H3PO40.5 mL,B)梯度洗脱(0~48 min,15%~26%A;48~49 min,26%~35%A;49~65min,35%A),流速1 mL·min-1,检测波长235 nm,柱温25℃。 2.1.4 对照品溶液的稀释 取含有苯甲酰新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的混合对照品储备液,用甲醇稀释成系列对照品溶液。进样10μL,测定各色谱峰峰面积,以对照品质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,结果见表1。 2.2 单因素试验 2.2.1 浸泡时间对各成分的制备影响 按处方量称取四逆汤中各药材,在加水20倍量煎煮2次,每次60 min的条件下,分别考察浸泡0,20,30,60,90,120 min对各成分煎出率的影响,结果见图1。说明在0~90min,随浸泡时间增加,各成分的煎出率升高,随后降低。故正交设计中浸泡时间水平定为30,60,90 min。 2.2.2 不同因素对各成分制备工艺的影响 按处方量称取四逆汤中各药材,在确定加20倍量水浸泡30 min,煎煮2次的条件下,分别考察煎煮20,40,60,90,120 min对各成分煎出率的影响,结果见图2。说明煎煮时间超过60 min后,随煎煮时间增加,各成分煎出率降低,故正交设计中煎煮时间水平定为20,40,60 min。 2.2.3 水加各成分中加速度的确定 按处方量称取四逆汤中各药材,在确定浸泡时间30 min,煎煮时间30 min,煎煮2次的条件下,分别考察加5,10,15,20,25倍量水对各成分煎出率的影响,结果见图3。说明当加水倍量在5~20倍时,随加水量的增加,各成分煎出率增加,之后增加水量无明显变化。故正交设计中加水量水平定为10,15,20倍。 2.2.4 烹饪时间的影响 2.3 其他影响甘草苷制备工艺的筛选 在单因素试验基础上,考察浸泡时间、煎煮时间、加水倍量、煎煮次数对各成分煎出率的影响,因素水平见表2。按处方量称取四逆汤中各药材,按L9(