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乌梅白凤丸有效成分对mpp诱导小鼠黑质神经元凋亡的影响 帕金森病（parkinson’sdisease，pd）是一种退行性中枢神经系统疾病，也是老年人常见的疾病。55岁以上的人发病率约1%。PD最主要病理特征是中脑黑质致密带(SNc)DA能神经元进行性变性、脱失及伴发的纹状体轴突末梢DA耗竭,从而导致基底节神经调节功能的紊乱。PD的典型症状为静止震颤、肌肉僵硬、运动迟缓及姿势反射异常。目前由于PD的发病机制仍不清楚,遗传、环境、自由基、兴奋性氨基酸毒性作用、线粒体功能障碍等多种因素可能与PD的发生有关,而细胞凋亡可能是导致PD病人DA能神经元死亡的重要原因之一。因此,抗细胞凋亡可能会起到保护DA能神经元的作用。 目前对于PD的治疗方案多是对症治疗,30多年来左旋多巴一直是做为首选药物,然而左旋多巴的长期应用也有明显的副作用,因此预防DA能神经元变性从而延缓PD的发生可能会成为一种替代治疗手段。乌鸡白凤丸有效成分(BFP)是一种广泛用于治疗妇科疾病的传统中药,并具有雌激素样作用活性,如降低血压、增加血管舒张度、减少血清三酰甘油、抗血小板活性以及刺激脑内 DA 释 放等多种药理作用,但目前其药理方面的实验研究鲜有报道。本研究以C57BL小鼠为研究对象,用MPTP制备PD小鼠动物模型,观察BFP预处理对MPTP导致的黑质DA能神经元凋亡是否具有保护作用,并对其机制进行了初步探讨。 1 材料和方法 1.1 酪氨酸羟化酶 C57BL小鼠由北京维通利华动物中心提供;BFP由香港中文大学生理系陈小章教授馈赠;酪氨酸羟化酶(TH)抗体、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)购自美国Sigma公司;TH免疫组化试剂盒、Bax抗血清、SABC试剂盒及DAB试剂盒由北京中山生物技术公司提供;高效液相色谱仪为美国Waters公司产品。 1.2 实验分组和治疗 10~11周龄C57BL小鼠36只,雌雄各半,体质量(20±2)g,于20~24 ℃室温及相对湿度50%~60%昼夜循环光照条件下生活,自由饮水、取食,实验前适应实验室环境1周。随机分为3组:①MPTP组:每天9:00给予小鼠腹腔注射MPTP(30 mg/kg),连用5 d;②BFP+MPTP组:每天9:00小鼠口服喂食BFP(3 g/kg),每天1次,连用14 d,第15天给予小鼠口服喂食BFP(3 g/kg),同时腹腔注射MPTP(30 mg/kg),每天1次,持续到第19天;③正常对照组:口服喂食等体积生理盐水。于每次注射药物后均观察小鼠行为变化。 1.3 th免疫组织化学染色 1.3.1 穿刺缓冲液制备 用80 g/L水合氯醛将小鼠麻醉后,行主动脉插管,快速灌注150~200 mL生理盐水冲洗血液,随即灌注300 mL含40 g/L多聚甲醛(4 ℃)的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB),先快后慢。然后断头取脑,置于同一固定液中4 ℃固定6 h,再置入含250 g/L蔗糖的PB液内4 ℃过夜或至脑组织块沉入瓶底。 1.3.2 冷冻切片 将脑组织块于冠状黑质平面连续冷冻切片,片厚20 μm。切片间隔分成2套,分别进行TH免疫组织化学染色和Bax免疫组织化学染色。 1.3.3 出现多次心理压力,加标回复突变1例 切片置入含体积分数0.003 H2O2的甲醛溶液中37 ℃孵育15 min,以消除内源性过氧化物酶活性,0.01 mol/L PBS(pH 7.4)冲洗,共3次,每次5 min;行抗原修复后滴加体积分数0.01的正常山羊血清,37 ℃孵育15 min,吸去山羊血清,加一抗(1∶5 000,用抗体稀释液稀释),于湿盒内4 ℃过夜;PBS冲洗,滴加生物素标记的二抗工作液,37 ℃孵育30 min,PBS冲洗;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液,37 ℃孵育30 min,PBS冲洗,DAB显色10~15 min,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,最后镜下观察并照相。阳性细胞为细胞浆和突起着棕黄色。 1.4 bax免疫组织化学染色 参照TH免疫组织化学染色方法,一抗为兔抗小鼠Bax(1∶200,用抗体稀释液稀释)多克隆抗体。阳性细胞为细胞浆着棕黄色。 1.5 视野内阳性细胞数和计数 取SNc最明显处的3张切片,在密集阳性细胞中央部分取4个互不重叠的高倍视野(400倍),计数视野内阳性细胞数,顺序为自上而下,由左至右,不完全位于视野内的细胞不计数,最后把各视野内的细胞数相加后再取平均数。 1.6 在图案str中，da及其代谢产物二羟苯乙酸dopac和高香草酸hva的含量测定 1.6.1 流动相倍比we DA、DOPAC、HVA的标准溶液最后用流动相倍比稀释得6个浓度梯度:每20 μL含16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 ng。 1.6.2 小鼠脑组