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丙烯酰胺对大鼠神经行为的影响及其机制研究 丙烯酸（acr）是工业、农业、国防等应用广泛的添加剂。2002年瑞典食品科学家于油炸食物中发现丙烯酰胺,立即引起世界各国食品管理和研究机构的高度重视。研究发现丙烯酰胺对人体有一定的神经毒作用,可引起急性、亚急性、慢性中毒。急性、亚急性中毒以中枢神经损害症状为主,突出的症状是小脑共济失调,慢性中毒以周围神经损害症状为主。黑质纹状体多巴胺能神经通路是基底神经节环路中的一个重要旁路,能通过影响基底节的直接和间接环路的活动调节基底节的输出。该系统在感觉运动整合、躯体运动及学习记忆方面发挥着重要的作用。ACR对人群和实验动物的神经损伤所表现出来的体征可能与黑质纹状体多巴胺系统的功能紊乱有关。本研究拟研究丙烯酰胺对大鼠黑质纹状体系统中单胺类神经递质多巴胺(DA)及其代谢产物二羟苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)、高香草酸(homovanilic acid,HVA)的影响,探讨其神经毒性的可能机制。 1 材料和方法 1.1 试剂的国内分析 试剂:丙烯酰胺纯度为99.9%,DA、DOPAC、HVA标准品均为美国Sigma公司产品。甲醇(上海国药)为色谱纯试剂,柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、高氯酸、磷酸均为国产分析纯试剂。 仪器:美国Waters1525型泵、Waters717plus自动进样器、Waters2475型荧光检测器、大连依利特Hypersil ODS2色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)、中佳KDC-160HR高速冷冻离心机、THERMO706-80℃超低温冰箱、国华HH-42数显恒温搅拌循环水箱、墨水、刻度尺、计时器、白纸等。 1.2 动物的检测 健康成年雄性SD大鼠14只,购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。实验动物置于室温(22±2)℃,湿度(50±10)%,12h∶12h光暗循环的实验室内,自由饮水、进食,检疫观察7天后用于实验。按体重随机分为2组,分别为对照组、ACR组,每组7只。每天上午8:00,ACR组以40mg/kg的ACR灌胃染毒,对照组灌胃等容量的生理盐水,连续12天观察大鼠日常行为状况。第0、3、6、9和12天,分别评定动物的步态分值、甩尾时间、后肢撑力指数。末次给药后24小时,断头处死大鼠,于冰盘上迅速分离纹状体,置于-80℃冰箱保存备用。 1.3 神经行为的观察指标 1.3.1 大鼠肢体受损状态 将实验动物置于空旷地面,让其自由活动,每只动物观察3分钟。1分:正常步态,未受影响;2分:轻度受损步态(大鼠后肢轻度无力,足张开,行走时后肢稍微外展);3分:中度受损步态(大鼠后肢中度无力,足张开,站立困难,不能正常行走,腹部着地,两腿叉开平铺行走或者划行);4分:重度受损步态(不能支撑体重,严重异常,后肢完全瘫痪和足底朝上)。 1.3.2 下肢支撑试验 1.3.3 对大鼠尾尾的保护 用苦味酸在大鼠尾部距离尾尖5cm处做一标记,将大鼠尾巴迅速置于(52±0.5)℃的水浴中至标记处,记录大鼠出现甩尾的时间。每只大鼠测定3次,每次间隔30min以上,取平均值作为记录值。 1.4 hplc荧光成像法检测da及其代谢产物的含量 1.4.1 标准曲线的绘制 DA、DOPAC、HVA标准品分别用0.1 mol/L高氯酸配制成100μg/ml的储备液,于-80℃低温冰箱中保存备用,临用时以流动相稀释。DA在0.0625~1μg/ml之间,DOPAC,HVA在0.3125~5μg/ml之间按照倍比关系设定5个浓度系列,取20μl进样,以峰面积绘制标准曲线,确定线性范围。所有实验用水均为去离子超纯水。 1.4.2 匀浆检测 取14只大鼠纹状体,分别加入0.1mol/L高氯酸600μl,放入1ml的玻璃匀浆器内,冰浴下匀浆。将匀浆液收集于1.5ml EP管中,于4℃,16 000r/min低温离心20min,取上清液再于4℃,16 000r/min离心10min,取20μl上清液进样检测。以保留时间定性,外标法定量。 1.4.3 流动相柱温 大连依利特Hypersil ODS2色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),柱温35℃,流动相:缓冲盐(0.02mol/L柠檬酸三钠和0.05mol/L磷酸氢二钠)/甲醇=95/5,流速1.0 ml/min。荧光检测波长λEX=285,λEM=333。 1.5 统计处理 使用SPSS 18.0软件进行独立样本t检验,检验标准α=0.05。 2 结果 2.1 acr大鼠的活动特点 对照组大鼠被毛光泽,活动正常,体重随着时间的增加而逐渐增长,ACR组大鼠从第3天开始活动减少、嗜睡、反应迟钝、躁狂、震颤。体重增长缓慢(见表1)。 2.2 行驶体验和术后随访 对照组所有大鼠在整个试验观察期内步态正常。ACR组