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复元胶囊对衰老性骨关节炎模型兔血清-sod、mda以及血液流变的影响 骨关节炎（oa）是老年人最常见的关节疾病和慢性屈曲。oa的病因非常复杂，其根源未知，没有有效的治疗方法。OA患者体内存在氧自由基含量和血黏度变化,目前普遍认为用中药复方制剂清除体内过剩氧自由基,降低血液黏度,为防治衰老性OA提供了研究途径。前期研究表明,复元胶囊具有抑制炎症细胞因子、软骨细胞凋亡的作用。本文采用皮下注射D-半乳糖联合右后肢膝关节伸直石膏固定法制作衰老性膝关节OA兔模型,检测模型兔血清氧自由基清除剂总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、毒性代谢产物丙二醛(MDA)浓度以及血液黏度,探讨复元胶囊防治膝关节OA的其他作用机制。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 中心提供20例 健康新西兰兔(重庆医科大学实验动物中心提供)52只,雌雄各半,体重(2.5±0.5) kg。合格证:SCXK(渝) 1.1.2 合成胶囊的制备 实验药物复元胶囊由鹿茸、淫羊藿、生晒参、黄芪、丹参等组成,重庆希尔安药业有限公司生产,科研批号(2005-B-18)。每粒胶囊重0.41 g,相当于生药3 g,仅供实验使用。对照药物奥泰灵由香港澳美制药公司生产(批号:国药 准字,规格为每粒含盐酸氨基葡萄糖750 mg。 1.1.3 血液流变学测定 酶标仪(Thermo Scientific 全波长酶标仪)、微量移液器、水浴箱、冰箱、离心机、试管,全自动血液流变测定仪、真空抗凝采血管,光学显微镜。以上仪器由重庆医科大学附属一院中心实验室提供。 1.1.4 试剂盒和mda试剂盒 冰醋酸、无水乙醇、双蒸水由实验室提供。SOD试剂盒(2009001) 和MDA试剂盒(2009002)均由南京建成生物工程研究所提供。D-半乳糖由美国Amerisco公司提供。 1.2 方法 1.2.1 各组单笼饲养 52只新西兰兔随机分为正常组、模型对照组、模型组、奥泰灵对照组、复元胶囊低剂量组、复元胶囊中剂量组、复元胶囊高剂量组。每只均单笼饲养。动物分组以及饲养方法。见表1。 1.2.2 管型石膏兔毛的制备 所有实验动物同等条件下适应性饲养1 w后,模型对照组采用伸直制动法建模:先剪去兔子右后肢踝关节以上的兔毛,用医用纱布裹上两层,再用管型石膏将其伸直位固定,石膏外以透明胶纸封好,以防兔撕咬,若石膏松动或脱落者及时重新固定,时间6 w,造成单纯性OA模型。模型组在模型对照组的基础上颈背皮下注射D-半乳糖30 mg·kg-1·d-1,时间6 w,造成衰老性OA模型。 1.2.3 给药 造模后第1周开始分组给药。根据Meeh-Ruber公式计算兔的给药剂量,饮用水溶解后灌胃,均每日定时一次性给药,用药6 w。 1.2.4 观察指标 1.2.4. 1一般情况 观察兔子精神状况、毛发、局部淤血轻重及关节灵活度等。 1.2.4. mt-sod活力测定 用药6 w后取标本:将兔断颈处死取血2 ml,经4 000 r/min离心后,取血清于-20℃低温冰箱中保存待测。采用羟胺法测定SOD活力,硫代巴比妥(TBA)法测MDA浓度。按SOD测定试剂盒步骤说明操作,确定有效取样量为10 μl,待测样在波长550 nm光下用酶标仪测定吸光度(A),根据公式测定T-SOD活力=[(对照管光密度-测定管光密度)÷对照管光密度]×662 U/ml。按MDA测定试剂盒步骤说明操作,取血清0.1 ml,待测样在波长532 nm光下用酶标仪测定其吸光度(A),根据公式MDA浓度=[(测定管光密度-测空管光密度)/(标准管光密度-标空管光密度)]×标准品浓度(10 nmol/L),计算MDA浓度。 1.2.4. 即时检疫,可选用即时检疫 用真空抗凝管取血3 ml,轻轻摇动采血管。在相同外界条件下,即时送检。采用全自动血液流变分析仪,检测各组全血黏度高切(mpas200/s)、全血黏度低切(mpas3/s)、红细胞刚性指数(TK)、红细胞电泳时间(tRBC)。 1.2.4. 软骨及软骨下骨组织协调染色 用药6 w后,处死家兔,立即切取家兔胫骨平台内侧关节面的完整软骨及软骨下骨组织标本,用10%的甲醛溶液固定48 h,脱钙2～3 d,石蜡纵向包埋固定,常规切片,苏木素-伊红(HE)染色。在光学显微镜下镜检各组动物的病理切片,观察软骨的病理改变。 1.3 统计分析 应用SPSS13.0统计分析软件处理,数据结果以xˉ±sxˉ±s表示,单因素方差分析,两组间比较用q检验。 2 结果 2.1 各组大鼠关节活动不利情况 模型对照组和模型组较正常组精神差,毛发光泽度下降,关节活动不利,制动右后肢局部不同程度淤血。奥泰灵组与模型组无明显差别。复元胶囊各组较模型组精神好,活泼爱动,毛发光泽度尚好,关节灵活度增大