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gdap1基因多态性分析在腓骨肌萎缩症中的应用 腓骨肌痉挛（cmt）是人类最常见的周围神经单胞遗传因素。发病率约为1/2500,临床主要表现为进行性对称性远端肌无力和萎缩、腱反射减弱或消失、远端感觉减退。依据病理和电生理特点主要可分为两型:CMT1型(脱髓鞘型)和CMT2型(轴索型)。此外有中间型CMT。遗传方式大多数为常染色体显性遗传,其次为X连锁显性遗传。常染色体隐性遗传相对少,其临床表现与常染色体显性遗传相似,但通常症状更重,发病年龄更小。GDAP1基因突变是导致常染色体隐性遗传CMT最常见的原因,约占总数的25%,GDAP1的蛋白质功能和突变蛋白的致病机理目前尚不明确,国外共发现11种GDAP1GDAP1基因在中国人腓骨肌萎缩症患者的突变情况,我们对其全部6个外显子及侧翼区进行了突变检测。 1 对象和方法 1.1 常染色体隐性遗传 8个隐性遗传的腓骨肌萎缩症家系和15个散发病例均来自以湖南省为主的我国南方地区,其中男12例,女11例,起病年龄2～25岁,诊断标准符合欧洲CMT联盟第2次会议1998年制定的标准。已经过突变分析初步排除PMP22的大片段重复突变和PMP22、MPZ、CX32、NEFL的点突变。入选常染色体隐性遗传的标准为近亲结婚家系中有一名以上的CMT患者,非近亲结婚家系中有两名以上同胞为CMT患者;散发病例是指非近亲结婚家系中有1名CMT患者。 1.2 方法 1.2.1 提取各组dna 23例先证者外周静脉抗凝血5～10ml,常规酚-氯仿法提取基因组DNA。 1.2.2 in工艺 21.5～2.0 mmol/L,gDNA为100 ng,Taq DNA聚合酶0.2 U。反应条件为:95℃预变性3 min,然后95℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸45 s,30个循环后于72℃终末延伸6 min,4℃保存。经6%聚丙烯酰胺凝胶检测扩增成功后,取7 μl PCR产物加等量的2×变性载样缓冲液混合,95℃变性10 min,上样于含8%甘油、交联度为49∶1的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中,8 W恒功率,4℃电泳24～30 h,常规银染观察结果。 1.2.3 序列分析 对SSCP分析出现异常单链构象带的PCR产物进行核酸外切酶酶切纯化、ABI3100型测序仪进行DNA序列分析。 1.2.4 gap1基因共态性测序 对GDAP1第4外显子和第6外显子发生序列变异的一个常染色体隐性遗传腓骨肌萎缩症家系先证者进行GDAP1基因全部6个外显子直接测序及3名家系成员(包括其弟弟,亦为CMT患者、其父亲和母亲,表型正常)GDAP1基因第4、第6外显子直接测序后共分离分析;对GDAP第6外显子发生序列变异的1例散发病例进行GDAP1基因全部6个外显子直接测序。 1.2.5 sscp检测 经测序证实的GDAP1第4外显子序列变异与150名健康对照(300条染色体)扩增的相应PCR片段一起进行SSCP检测;第6外显子序列变异产生了一个酶切位点,能被限制性核酸内切酶SalⅠ特异性酶切为135 bp和152 bp两个片段,将该序列变异与150名健康对照(300条染色体)扩增的相应PCR片段一起进行SalⅠ限制性核酸内切酶酶切检测。 2 结果 2.1 pcr-sscp检测结果 对8个隐性遗传的腓骨肌萎缩症家系先证者和15名散发病例共23例患者的PCR-SSCP检测后发现,第4外显子出现4种不同的单链构象,第6外显子出现1种异常的单链构象。 2.2 杂合t507g的树种 GDAP1基因的第4外显子有3种序列变异,分别为杂合A533G、纯合T507G、杂合T507G;第6外显子有1种序列变异,为杂合A767G。 2.3 复合杂合变异的父母 常染色体隐性遗传腓骨肌萎缩症家系中两名患者均存在A533G和A767G的复合杂合变异。经测序证实杂合A533G来自其父亲(图1、2),杂合A767G来自其母亲(图3、4);散发病例只存在杂合A767G的序列变异。 2.4 t507g+5.3g+t507g+5. 150名健康对照第4外显子有纯合T507G、杂合T507G相应带型,无杂合A533G相应带型;SalⅠ限制性核酸内切酶对150名健康对照第6外显子的酶切未见酶切片段产生。 3 常染色体隐性遗传cmt的致病基因 GDAP1基因由6个外显子组成编码区,编码的蛋白质神经节苷酯诱导分化相关蛋白1由358个氨基酸组成。GDAP1的确切功能目前还不明了,其氨基酸序列与体内防止细胞衰老的抗氧化系统谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GSTs)具有同源性,比较基因组学和结构预测分析表明GDAP1与GSTs家族成员相比,其GST结构域Ⅱ有一延长区域,C-端存在跨膜区。GDAP1在多种组织中表达,脑和脊髓的表达水平最高。