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一株高产红色色素的sm-128菌株的分离鉴定 灵菌红素是一种天然红丝素家族的总称，是由几种放线菌和细菌引起的二次代谢产物。1929年，amako等人在研究serratia的生长时发现了沙雷氏菌，并从harasima等人那里获得了这些物质。随后，相关研究人员开始关注这件作品的性质和生物活性。随着研究的深入，人们对它的许多生物学活性有了认识，包括抗细菌、抗疟疾、抗真菌和抗原生动物。然而，人们对这种物质的脱毒反应活性和肿瘤细胞的死亡感兴趣。 目前国内相关研究集中于灵菌红素生产工艺的研究,着重于高产菌种的获得和生产工艺的优化方面,以提高该天然色素的产量,降低生产成本. 本研究通过筛选自然生境中产色素菌株,从淡水鱼体中分离得到一株高产红色色素的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),编号为Sm-128菌株.通过紫外吸收光谱及薄层色谱实验,结合前人的研究结果,证实其所产色素为灵菌红素.用甘油培养基培养Sm-128菌株,灵菌红素粗品产量可达475 mg/L.Sm-128菌株生长快、周期短,生长条件粗放,生产色素能力强,性状稳定,可为工业化生产灵菌红素提供优质的菌种资源. 1 材料和方法 1.1 来源：蘑菇 高产灵菌红素沙雷氏菌株分离自浙江金华水库淡水鱼体,编号为Sm-128,由本实验室保藏. 1.2 培养基 1 pda培训 马铃薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,琼脂20 g/L,自然pH. 2 50lb培养基 胰化蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,琼脂20 g/L, pH 7.0～7.2. 3 液体培养基甘油蛋白 蛋白胨5 g/L,甘油10 mL/L,自然pH. 1.3 ph、水质、水浴锅 紫外可见光分光光度计;旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);循环水式多用真空泵;精密pH计;电子分析天平;电热恒温水浴锅;显微镜(Leica,德国)等. 1.4 以鱼类为受精菌株1-33 选取不同生境的材料,以PDA培养基和LB培养基作为筛选培养基.从鱼体等生境中筛选产生色素的菌株,方法(以鱼体为例)如下:取浙江金华地区水库淡水鱼,取其内脏切碎,以无菌水浸泡2 h,采用浓度梯度稀释法,选择合适浓度(10-2,10-3)的样液,取200 μL涂布于PDA培养基上,28 ℃恒温培养,得红色菌落.挑取红色菌落,用连续划线法纯化,获纯菌株128-130. 1.5 颜色分析 1.5.1 无水乙醇的提取 通过测定色素分子对紫外/可见光的吸收,可以鉴定和定量分析大量的无机化合物和有机化合物.用药匙从平板上刮取红色菌苔,以无水乙醇作为浸提液,在研钵中充分研磨提取,收集融入色素的无水乙醇溶液,反复提取直到无水乙醇液不变色.将收集的无水乙醇溶液进一步离心,得上清液,在紫外分光光度计下测定并绘制上清液的吸收光谱图. 1.5.2 提取溶剂的选择 薄层色析法(TLC)是高效的色谱分离和高灵敏度的检出少量物质的一种实验技术,也是判断样品纯度的有效、简单、快捷的方法.灵菌红素提取常用的溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯及石油醚等,这些溶剂各具优缺点.结合文献,最终选定展开剂为:V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=1 ∶1.根据色素在色谱板上的分离效果及Rf值,再结合文献,判断色素的性质. 1.5.3 灵菌红素发酵 从活化的LB培养基上挑取约2环菌种接入培养液中,28 ℃,150 r/min培养12 h,再以3%的接种量接入发酵培养液中,在28 ℃,150 r/min培养24 h,可得含灵菌红素的菌体,并有少量目的产物在培养液中. 发酵液以10 000 r/min离心15 min,并重复洗涤3次后得菌体和培养液.菌体直接用无水乙醇作为浸提液,辅以超声波破碎进行色素浸提,离心得上清液,反复多次直至菌体无颜色.收集上清液,经旋转蒸发仪浓缩,得色素粗品,称量,计算产量. 1.6 细菌的鉴定 1.6.1 形态观察 纯化后的菌株分别接种于PDA培养基、LB培养基中,28 ℃培养2 d,取菌体先用简单染色法和革兰氏染色法染色,再用显微镜观察拍照. 1.6.2 生理生化特征的分析 菌株用LB培养基28 ℃培养连续观察5 d,进行糖发酵、氧化酶、触酶、尿素酶和H2S、甲基红等实验220-225. 1.6.3 ssr-pcr检测 菌株基因组DNA的提取参照文献的方法.利用细菌的16S rDNA通用正反向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,以基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)扩增.PCR程序为:98 ℃ 5 min,95 ℃ 35 s,55 ℃ 35 s,72 ℃ 1 min 30 s,35个循环,延伸8 min.PCR扩增用Taq酶,产物连入克隆载体pUCm-T后,由上