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中药提取物-巴马中水和乙醇提取物抗氧化活性研究
马蹄是蔷薇科植物的一条完整菌株。它被称为粘土、鸡肠、地衣菊、路边菊、软草、鸡冠草、风草等。广泛分布于亚洲南部和东部。我国主要分布在江苏、浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、海南、广西、四川、贵州等地。马兰味苦、辛,性温、寒,以全草或根入药。据《本草纲目》载:根、叶,主诸疟及腹中急痛,痔疮。现代医学认为,马兰头性凉味辛,有凉血、清热、利湿、解毒等功效。
近年来,国内文献报道了对马兰头的初步研究,多集中于繁殖方法及栽培技术;另外李义提取了马兰中水溶性粗多糖;林材等从马兰中分离鉴定出6种化合物;康文艺等、马英姿等运用气-质联用研究了马兰挥发油成分。王贵军等提取测定了马兰中黄酮类化合物的含量。鉴于马兰药食两用的多重功效,本实验探讨马兰提取物的抗氧化活性,为进一步揭示马兰的生物活性提供参考。
1 材料和方法
1.1 化学试剂的制备
马兰购于南京六和蔬菜基地;芦丁(95%)实验室自制。
无水酒精、丙酮、乙醚、甲醇、氢氧化钠、K3Fe(CN)6、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸铜、氯化亚铁、双氧水、邻苯三酚(焦性没食子酸)、抗坏血酸(分析纯)南京化学试剂有限公司;Ferrozine、DPPH、鲁米诺Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 提取脱色兰马
马兰→用清水洗净污泥→去除老黄叶→晒干→粉碎→过筛(20目)→乙醚脱脂→石油醚脱色→残渣通风干燥→水提取脱脂脱色马兰粉(料液比1:9(m/V),60℃搅拌反应50min,进行两次)→4000r/min离心20min→取上清液;残渣以同样方法重复提取1次→合并上清液→减压浓缩→冷冻干燥
1.2.2 提取测定实验
1.2.2. fecl3与铁氰化钾溶液的相互作用
取1g/100mL FeCl3溶液,向待测液中滴加该溶液,观察颜色变化。配制2g/100mL FeCl3溶液和1g/100mL铁氰化钾溶液等体积混合,向待测液中滴加该溶液,观察颜色变化;加入HCl溶液,观察颜色变化。配制1g/100mL AlCl3溶液,向待测液中滴加该溶液,观察颜色变化。
1.2.2. 2液体提取和全波长扫描
分别对马兰的乙醚、石油醚萃取物、马兰水提液和马兰乙醇提取液进行全波长扫描。
1.2.3 标准曲线方程
准确称取芦丁标准品11.7mg,用70%的乙醇定容至50mL容量瓶中。分别取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL于8个10mL容量瓶中,用70%乙醇补充至5mL,加入0.3mL 5g/100mL的NaNO2,摇匀,放置6min后加入0.3mL 10g/100mL Al(NO3)3,摇匀,6min后加入4mL 4g/100mL的NaOH,混匀,用70%乙醇定容,10min后于510nm波长处比色测定。得标准曲线方程为:y=0.011x-0.0027,R2=0.9994。
同样方法测定并计算马兰提取物中黄酮类化合物含量。
1.2.4 木兰提取物的抗氧化性实验
1.2.4. 氯乙酸反应时间
据文献报道方法,精确移取马兰提取物,稀释成一定浓度的溶液,取1mL不同浓度梯度的各样品,加入2.5mL 0.2mol/L,pH6.6磷酸盐缓冲液和2.5mL 1g/100mL K3Fe(CN)6,混合均匀,于50℃反应20min。取出再加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸。而离心10min,取上层溶液5.0mL加入蒸馏水5.0mL,0.1g/100mL FeCl31.0mL,用分光光度计于700nm波长处测定吸光度。
1.2.4. ferrzne-fe2+抑制率测定
参照文献测定方法,精确移取马兰提取物,稀释成一定浓度的溶液,取1mL不同浓度梯度的各样品,加入0.05mL 2mmol/L FeCl2溶液,再加入0.2mL 5mmol/L Ferrozine开始反应,剧烈振荡混合物,而后室温下保持10min。分光光度计于562nm波长处测定吸光度。所有测定值均为3次平均值。混合体系中Ferrozine-Fe2+抑制率计算如式(1)。
式中:A0为空白吸光度;AS为样品吸光度。
1.2.4. dpph自由基清除率测定
参照文献[10-11]方法,精确移取马兰提取物,稀释成一定浓度的溶液,取0.5mL不同浓度梯度的各样品,依次与2.5mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液室温避光反应30min,于517nm波长处用紫外分光光度计测定吸光度,以甲醇为空白,计算DPPH自由基清除率。
式中:A0为空白吸光度;AS为样品吸光度。
1.2.4. 黑铜带来源样品中cps,空白光照质量检测
选用VC-Cu2+-H2O2-酵母多糖体系产生·OH,移取不同浓度的马兰提取物进行抑制,用化学发光法测定。发光杯中依次加入2mmol/L的VC溶液200μL(现配),2mmol
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