细胞自噬与神经疾退行性疾病课件.pptxVIP

细胞自噬 及其在神经退行性疾病中的作用 神经退行性疾病 目 录 细胞自噬 发生过程 基本概念 特点 调控 检测 AD HD PD Autophagy 一词来源于希腊语， auto指自身、 phagy是吃的意思， autophagy意为自体吞噬， 简称自噬。 基本概念 自噬 溶酶体 自噬在进化过程中高度保守，从酵母、果蝇到脊椎 动物和人都可以找到参与自噬的同源基因。目前至少已 经鉴定出33种参与酵母自噬的特异性基因。其命名从最 初称为APG ，AUT和CVT，现已被统一命名为酵母自噬 相关基因ATG(autophagy-related gene ，ATG)。哺乳 动物自噬基因的命名和酵母相似，但也有个别差异，如 酵母的ATG8在哺乳动物称为LC3，酵母晦ATG6在哺乳 动物则称为Beclin 1。 基本概念 自噬相关基因 基本概念 自噬相关蛋白 根据其降解底物的特异性分类 • 非选择性自噬：随机 • 选择性自噬：专一 – 线粒体自噬 (Mitophagy) – 内质网自噬 (ER-phagy) – 过氧化物酶体自噬 (Pexophagy) – 细胞核自噬 (Nucleophagy) 基本概念 分类 根据自噬的过程分类 • 大自噬(Macroautophagy)—主要 • 小自噬(Microautophagy):指溶酶体膜直接内陷包裹底 物并降解的过程。 • 分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy， CMA):热休克蛋白70(Hsp70)与溶酶体相关膜蛋白2A (AMP2A) 基本概念 分类 模式图 调 控 ü自噬上游调控 ü自噬过程调节 生理条件下, 细胞自噬受到严格的调控。 现在了解得比较多的细胞自噬调控通路主要 有两条: mTOR通路和Ⅲ型PI3K通路。很多 其他细胞自噬调控信号直接或间接的通过这 两条通路发挥作用。 调 控 上游调控 mTOR 对细胞自噬起到负调控作用。在正常生 长条件下,mTOR处于激活状态, 细胞自噬受到抑 制;当细胞处于饥饿或受到雷帕霉素刺激时,mTOR 被抑制,细胞自噬被诱导增强。 ü 丝裂原刺激信号 ü 能量感受信号 ü 胰岛素信号 ü 氨基酸信号 ü p53通路 调 控 mTOR通路 Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶 (PI3K Ⅲ)是一个正 调控蛋白，它能够磷酸化磷脂酰肌醇(PI),生 成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)，而后PI3P利用 胞质中的蛋白质形成自噬体膜。 PI3K Ⅲ也能与Beclin-1形成复合体，该复 合物在自噬体形成的起始阶段起重要作用。 调 控 通路 PI3K Ⅲ Ø 起始:Atg1复合体 Ø 膜的扩增与底物识别选择:Atg12-Atg5和 Atg8分别泛素化修饰 Ø 自噬体成熟与降解 Ø 自噬过程中的其他重要成员:分泌与内吞途 径和细胞骨架 调 控 自噬过程调节 调 控 自噬的调控 调 控 1电镜技术 • 普通透射电镜技术 • 免疫电镜技术 2化学和免疫化学染色法 • 基于自噬标记蛋白的检测方法 • 标记自噬溶酶体结构的检测技术 检 测 普通透射电镜技术 • 在超薄切片上可清晰地观察到自噬结构的形态和构 造，实验指标包括细胞自噬水平和自噬结构的变化， 前者是指发生自噬的细胞出现率，后者以自噬细胞 内自噬结构数目或自噬结构与细胞质的断面面积之 比衡量 免疫电镜技术 • 可标记位于自噬前体和自噬体内外膜上的LC3，该方 法可用于鉴别自噬前体，自噬体和自噬溶酶体 检 测 电镜技术 普通透射电镜技术 检 测 普通透射电镜技术 检 测 1基于自噬标记蛋白的检测方法 • 自噬体数量检测—免疫荧光/组织化学技术 • 蛋白表达量检测—Western-blot 2标记自噬溶酶体结构的检测技术 • 单丹磺酸戊二胺(MDC)染色 • 吖啶橙(AO)染色 化学和免疫化学染色法 检 测 自噬类别 相关环节 标志物 大自噬 自噬体的形成 LC3 (Atg8) Beclin 1 (Atg6) Atg5-Atg12 Atg 16L Atg9 Atg14 DRAM1 ZFYVE1/DFCP1 溶酶体 LAMP-1 LAMP-2 自噬底物 p62 分子伴侣自噬 LAMP2A HSC70 线粒体自噬 Atg32 BNIP3 自噬标记蛋白 检 测 GFP-LC3指示技术 检 测 雷帕霉素处理 NDV感染 阴性对照 免疫荧光染色-LC3B 检 测 氯奎处理组 对照组 检 测 Western Blot 标记自噬溶酶体结构是以往应用 较为广泛的活体检测技术。 MDC 和 AO 是常用的嗜酸性染料，用于标记 酸性细胞器。当溶酶体内容物为酸 性时，可获得阳性染色信