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产酯酶微生物的筛选 作为一种重要的工业酶，微生物表面活性剂（ep3.1.1）广泛应用于医药、化工、食品等行业。例如，非对称合成、酯合成、酯交换剂、多媒体合成和其他加速反应。产脂肪酶微生物菌种的筛选研究报道较多,如邬敏辰、陶文沂、王美英、金其荣等利用油脂为唯一碳源的油脂同化试验来筛选;Satyanarayana利用固体培养基通过相应底物所释放游离酸来确定酶活性的大小;还有用生色底物或产脂肪酶微生物的某些特性,如Yeoh用生色底物如对硝基苯辛酸酯、对硝基苯豆寇酸酯及对硝基苯棕榈酸酯而筛选到对不同碳链长的脂肪酸具有专一性的产脂肪酶微生物;李祖义则用显色剂Rhodamine B和一定浓度橄榄油的平板筛选法。产酯酶微生物的筛选也有一些研究,如Guillermo等研究者利用一种新的透明圈变色法来筛选酯酶产生菌,结果比传统的筛选法有更清晰和明确的变色透明圈。与产脂肪酶菌种的筛选研究相比产酯酶微生物的筛选报导较少。本文研究了产酯酶微生物的筛选,包括筛选模型、酶活力检测方法以及菌株的分布情况。 1 材料和方法 1.1 土壤样品和细菌的来源 筛选样品来源于酒厂、内酯化工厂、乳品厂、油脂厂、肉联厂、食堂等长期与酯类及油脂接触的土壤和污油水样,还包括实验室所保存的菌种。 1.2 菌的初步筛选 1.2.1 b三醋酸甘油酯/乳酸乙酯/h 牛肉膏20.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,(NH4)2SO45.0 g/L,K2HPO45.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.0 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,NaCl 0.5 g/L,调pH至7.2,0.08MPa灭菌20min后加入三醋酸甘油酯10.0 mL/L和乳酸乙酯10.0 mL/L。 1.2.1.2初筛平板培养基 牛肉膏20.0 g/L,K2HPO41.0 g/L,(NH4)2SO41.0 g/L, MgSO4·7H2O 1.0 g/L,NaCl 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,琼脂15.0 g/L,溴甲酚紫0.04 g/L,调pH至7.2,0.1MPa灭菌20min后加入三醋酸甘油酯30.0 mL/L。 1.2.1.3肉汤斜面培养基 牛肉膏3.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,琼脂18.0 g/L,pH7.0,0.1MPa灭菌20min。 1.2.2 蘑菇培养基 1.2.2. 醋酸甘油酯溶液 酵母膏20.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,K2HPO42.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,自然pH值,0.08MPa灭菌20min后加入三醋酸甘油酯30.0 mL/L。 1.2.2. 醋酸甘油酯溶液 酵母膏10.0 g/L,琼脂15.0 g/L,溴甲酚紫0.04 g/L,自然pH值,0.08MPa灭菌20min后加入三醋酸甘油酯30.0 mL/L。 1.2.2. 3.侯爵斜坡培养 马铃薯200.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,琼脂18.0 g/L,自然pH值,0.08MPa灭菌20min。 1.2.3 初步过滤方法 1.2.3. 角瓶发酵培养 取土壤样品1g或污油水样2 mL加入装有25 mL富集培养基的250 mL三角瓶中,在32℃下,150 r/min摇瓶发酵培养。筛选细菌富集48 h,霉菌富集96 h,再移取5 mL培养液至另一盛有富集培养基的三角瓶中继续培养。如此重复3次,然后进行稀释涂布平板分离。 1.2.3. 菌初筛平板 将富集过的培养液用无菌水稀释,分别涂布在细菌和霉菌初筛平板上。32℃培养,相隔6 h定期观察结果,将具有变色圈的菌落选出,挑至斜面培养基上培养,待菌苔长出镜检直至获得单株纯培养后斜面保存,备用。 1.3 细菌复过滤 1.3.1 醋酸甘油酯溶液 牛肉膏20.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,K2HPO41.0 g/L,(NH4)2SO41.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.0 g/L,NaCl 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,调pH至7.2,0.8MPa灭菌20min后加入三醋酸甘油酯20.0 mL/L。 1.3.1.2霉菌复筛培养基 酵母膏20.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L, K2HPO41.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.0 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,自然pH值,0.8MPa灭菌20min后加入三醋酸甘油酯50.0 mL/L。 1.3.2 粗酶液的提取 将初筛的菌株接入装有25mL复筛培养基的三角瓶中,在32℃,150 r/min,细菌培养36 h,霉菌培养72 h,培养后的发酵液在4℃,15000 r/min离心,上清液即为粗酶液。 1.3.3 醋酸甘油酯染色 ① 琼脂15.