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苯酚硫酸法测定白及多糖的研究 随着肿瘤免疫研究的深入，一些高等植物茶多酚和其他免疫抗癌药物已受到国内外广泛使用。在这些糖的提取、提取和制备过程中，需要多次测量这些糖的含量。目前测定糖的方法有多种, 我们在白及多糖测定时用的是苯酚—硫酸法。据资料介绍此方法在测一些单糖和多糖时, 效果较好, 但白及多糖是一种复合多糖, 该方法中的条件是否适用其测定, 我们在这方面进行了一些试验, 结果较为理想。 1 材料和方法 1.1 仪器 721分光光度计 (上海第三分析仪器厂) 。 1.2 合成苯酚 浓硫酸 (A.R.) (天津市化学试剂三厂) , 80%苯酚溶液 (80 g重蒸苯酚加入20 ml重蒸馏水) , 6%苯酚 (临用前以80%苯酚配制) , 白及多糖样品 (由南开大学分子生物学研究所提供) , 葡萄糖 (A.R.) (天津市化学试剂三厂) 。 1.3 方法苯酚硫酸法 1.3.1 吸光度测定 吸取葡萄糖标准溶液 (40μg/ml) 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8 ml各加水补至2.0 ml, 然后加入6%苯酚1.0 ml及浓硫酸5.0 ml, 静置10 min, 摇匀, 室温放置20 min后于490 nm测吸光度 (A) 。以糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标, 得标准曲线。 1.3.2 样品测定 吸取样品液1.0 ml (相当于40 μg左右的多糖) 按上述步骤操作, 测吸光度, 以标准曲线计算糖含量。 2 影响因素的讨论 2.1 葡萄糖、d—波长的选择 从文献上查到不同的糖其吸光度对波长的吸收曲线各不相同, 葡萄糖在490 nm有最大吸收、D—木糖在480 nm有最大吸收。测得白及多糖在此显色体系的吸收曲线 (见图1) , 知白及多糖在490 nm有最大吸收。 2.2 吸光度与含量的关系 取粗多糖溶液 (含粗多糖43.4 μg/ml) , 分别吸取此溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 ml在490 nm测定结果如图2, 吸光度与含量成线性关系。 2.3 用量曲线及用量曲线 在其它条件不变的情况下, 只改变苯酚量, 各测其吸光度, 得到吸光度—显色剂用量曲线。从曲线可知, 初始时随着苯酚量的增加吸光度变化较大, 而当苯酚量增到一定值后, 吸光度相对变化较小, 即颜色的强度达到极大值后吸光度对于苯酚量的曲线在此点以后相对平坦, 这与参考文献中介绍的其它糖与苯酚量的变化情况相似。 2.4 n颜色特征 白及多糖与显色剂反应, 10 min颜色达最深。从测定时的时间记起, 我们对颜色的稳定性进行了测试 (见表1) , 在室温下颜色很稳定。 2.5 加糖试验 做比较试验:取两支试管加入等量的白及多糖, 一支加入20 μg白蛋白、另一支不加, 同样也用葡萄糖做试验。结果基本相同, 可见蛋白质的存在不干扰测定结果。 3 结论 3.1 在测量白色和茶多酚含量时，波长为490 nm。 3.2 总糖含量为8.60 μg之间, 与吸光度呈很好的线性关系。 3.3 在苯硫酸法中，苯的用量为1.0 ml, 此量对测白及多糖较适宜。 3.4 虽然蛋白质的存在对测定结果没有显著影响 综上所述, 苯酚—硫酸法可用于白及多糖含量的测定, 且简单易行、快速灵敏、颜色稳定性及重复性好。