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衣霉素对乳鼠心肌细胞凋亡的影响 内质网应激导致细胞凋亡 心肌细胞的死亡与心率障碍、动脉硬化、急性冠状动脉综合征、心肌缺血再注、心肌病、心肌疾病、先天性心脏病、心力衰竭和其他心血管疾病密切相关。死亡受体途径和线粒体途径是心肌细胞凋亡的两种主要方式。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在心血管疾病导致的心肌细胞凋亡过程中发挥了重要作用,成为近期研究的热点。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是真核细胞内重要的细胞器,主要参与膜蛋白和分泌蛋白修饰和折叠。内质网对外界环境较敏感,各种应激所导致的代谢异常、蛋白质糖基化抑制、二硫键形成障碍等均可引起错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集,破坏内质网稳态,引发内质网应激(ERS)。应激发生后,内质网通过上调分子伴侣GRP78表达、抑制蛋白质合成、加速错误折叠和未折叠蛋白质降解等方式缓解ERS。然而持续或/和较严重的ERS则触发凋亡信号,诱导CHOP、caspase-12、JNK等促凋亡因子的表达及活化,导致细胞凋亡。尽管已有衣霉素通过内质网应激诱导细胞凋亡的报道,但目前尚缺乏构建心肌细胞凋亡的模型。为此,本研究应用衣霉素对心肌细胞进行干预,通过MTT实验检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞凋亡率和Western blot观察伴侣分子GRP78和CHOP的表达,为进一步探讨内质网应激诱导心肌细胞凋亡性相关疾病的机制提供了基础。 1 材料和方法 1.1 常用试剂 Sprague Dawley(SD)大鼠1日龄乳鼠由第四军医大学实验动物中心提供,高糖DMEM培养基(Gibico),胎牛血清(Gibico),Ⅰ型胶原酶(Sigma),MTT(Sigma),DMSO(Sigma),衣霉素(Sigma),胰蛋白酶(Sigma),5-Brdu(Sigma),Anti-GRP78(bioworld),Anti-GADD153/CHOP(Santa Cruz),β-actin(博士德),AnnexinⅤ/PI凋亡试剂盒(BD),BCA蛋白定量试剂盒(Pierce)。 1.2 细胞悬液的制备 取1日龄新生SD仔鼠,在70%酒精中浸泡数秒,用眼科弯剪沿剑突偏左侧下剪,取出心脏,冰PBS清洗3次,剔除新房及大血管,转入同位素瓶,用眼科直剪将其剪成1mm3组织块,1mg/ml的胶原酶分5次消化,每次5-7min。收集除第一次消化的细胞悬液,加入含血清的DMEM培养基终止消化,1000r/min离心5min,弃上清。重悬细胞,用滴管吹打至单细胞悬液,经200目筛网过滤后接种于培养瓶,差速贴壁1h。取细胞悬液,加入100umol/l的Brdu,24h后换液。通过倒置显微镜观察细胞形态及搏动,α-actin细胞荧光鉴定心肌细胞纯度达90%以上时进行实验。 1.3 衣激素对心肌细胞的影响 未处理的心肌细胞作为对照组,应用25ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml,500ng/ml衣霉素作用心肌细胞,分别在0h,24h,48h,72,96h进行各项指标检测。 1.4 mtt法检测细胞存活率 心肌细胞按照5×105/ml的浓度接种于96孔板,每孔100ul,经无血清培养液处理后,随机分组,每组设12个副孔:(1)对照组,(2)衣霉素组(25ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,500ng/ml)。分别刺激0h,24h,48h,72h,96h后每孔加入MTT溶液10ul(5mg/ml),37℃继续孵育4h,吸弃孔内上清液,加入150ul DM-SO,选择570nm波长,振荡10min,检测各孔吸光度A值(A值与活细胞数成正比),以只加DMSO的孔测得的值为本底A值,计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组A值-本底A值)/(对照组A值-本底A值)×100%,实验至少重复3次。 1.5 细胞凋亡检测 参照试剂盒说明书进行实验。100ng/ml衣霉素与心肌细胞共同培养0h,24h,48h,72h,96h后,0.25%胰酶消化细胞,每组收集约1×106个细胞,用冰PBS洗涤2次,70%乙醇固定,4℃过夜,Annexin V/PI染色,经流式细胞仪检测,分析细胞凋亡情况。结果判断:左下象限为正常细胞,右下象限为早期凋亡细胞,右上象限为晚期凋亡细胞,左上象限为死细胞。 1.6 实时荧光定量检测odeys 收集各时间点蛋白样品,12%SDS,85V电泳30min后将电压调制125V,待溴酚蓝跑出胶板时停止电泳。100V、2h将蛋白样品转移至NC膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1h。加入稀释后的GRP78(1:1000),CHOP(1:500),β-actin(1:1000),4℃孵育过夜。TBST洗膜3次,每次5min。加入荧光二抗(1:15000),室温孵