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无创性产前诊断技术在唐氏综合征中的应用 非全体染色是胎儿最常见的染色体畸形，也是胎儿出生缺陷最常见的病因之一。其中，唐英综合征是最常见的。唐氏综合征又名21-三体综合征 (21-trisomy syndrome) 或先天愚型, 在新生儿中发病率约为1/800。所以对先天性遗传病的产前检查、诊断是优生优育的重要保证。目前, 唐氏综合征的产前检查对孕妇和胎儿都易造成危险, 且检测指标也受多种因素影响。因此, 急需一种安全、简便、可靠的无创性产前筛查诊断技术。本研究综述了母血胎儿细胞、胎儿游离DNA、胎儿游离RNA的研究进展, 并对其未来趋势进行展望, 探讨其理论意义和实用价值。 1 胎儿细胞分离和富集技术的研究 1969年有研究者在孕妇外周血中发现男胎的细胞分裂相, 提出母血中可能存在胎儿细胞的假说。基于此, 1979年又有研究者利用荧光激活细胞分类技术首次从孕妇血中分离出胎儿细胞。此后的十几年研究者一直致力于胎儿细胞分离和富集技术的研究, 主要是对胎儿有核红细胞的分离, 因为它携带了胎儿基因组DNA的全部遗传信息。并且利用定量聚合酶链反应 (PCR) 和荧光原位杂交 (FISH) 准确诊断出胎儿性别和21-三体。但胎儿细胞在孕妇血中含量非常稀少, 且富集技术价格昂贵、效率低、灵敏度也不高, 因此一定程度上限制了其临床应用和发展。2002年, 美国儿童健康和发展研究所 (national institute of child health and development, NICHD) 对临床2 744例样本进行的相关研究证实了这点。因此, 需要寻找一种新的方法, 如直接检测母体循环血中胎儿核酸等。 2 产前无创伤性产后抑郁症的诊断和非全体病的可能性 2.1 引物筛选中的表观遗传标记 1977年, 研究者首次报道癌症患者血中存在游离DNA, 随后研究者在女性癌症患者血浆中检测出肿瘤相关癌基因突变, 并且在小细胞癌患者血浆中检测出微卫星改变。通过这一启示, 1997年, Lo等在怀有男胎的孕妇外周血中检测出胎儿Y染色体特异性DNA序列, 由此为无创性产前诊断开辟了新纪元, 取得了本质上的重大突破。 据报道, 胎儿游离DNA最早可于怀孕后5周在母血中测出, 为无创性产前诊断提供了新的可能性依据, 在很大程度上降低孕妇的身心负担。研究发现, 胎儿游离DNA浓度在21-三体和13-三体男胎的孕妇血中高于正常孕妇, 而在18-三体的孕妇中无差别。Lo等用定量PCR分析发现胎儿游离DNA在孕妇生产后1 d消失, 平均半衰期为16.3 min。胎儿游离DNA的更新和凋亡可能与滋养层细胞凋亡有关。早期报道胎儿游离DNA占母体血浆总DNA的3%~6%。2008年, Lun等使用具有高精确性和灵敏性的微流体数码PCR技术定量检测母体血中胎儿游离DNA, 结果显示在妊娠的前3个月母血中胎儿DNA的浓度至少是先前报道的2倍。 基于此, 许多研究者致力于提取DNA技术的研究。2004年, Chan等检测出胎儿DNA片段长度为193~313 bp, 远小于母血中的DNA长度。随后Li等用琼脂糖凝胶电泳从母血中成功分离出短的胎儿DNA片段。但这种方法只能用于定性检测且操作费时而且容易引起样本污染。另外, Dhallan等报道利用甲醛可以减少母体血浆背景影响, 以提高胎儿DNA的富集效率, 这种方法尚存争议。近年, 有研究者结合大小分级分离法和全基因组扩增 (whole genome amplification, WGA) 法提高了胎儿游离DNA的富集效率。尽管如此, 母体血中DNA仍然占主要部分, ccffDNA用于无创性产前检测在很大程度上还会受到母源性血浆背景的影响, 所以利用传统的PCR定量检测胎儿DNA会和母体血浆中DNA有一定的重叠。此外, 用胎儿游离DNA只能检测出父源性遗传的基因突变, 对母源性遗传的检测还有一定限制。解决上述困难需要改进技术提高胎儿DNA浓度以减少母体血浆背景的影响, 或者寻找不依赖于胎儿性别和母体血浆的胎儿特异性标志物。 因此, 对于胎儿DNA检测的技术方法, 表观遗传的变化开始受到研究者的广泛关注。近几年比较热门是表观遗传学改变、数字化PCR和大量平行基因组测序 (massively parallel genomic sequencing, MPGS) 。2002年, Poon等检测出母体和胎儿间不同的甲基化模式, 首次将表观遗传标志物用于无创性产前诊断。随后, Chim等研究发现定位于18号染色体的编码maspin的SERPINB5基因在胎盘中处于低甲基化, 而在母血中高甲基化。因此, 通过表观遗传等位基因比率法, 就可以诊断18-三体的患儿。Chan等也发现RASSF1A基因在胎盘中高甲基化而在母血中处于低甲基化状态。