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无创性产前诊断技术的研究进展 非全体异常是一种常见的胎儿遗传疾病，发病率占出生胎儿的1.300%。最常见的非整倍体异常即为21-三体综合征 (唐氏综合征) , 其发生率约为1/800。人们通过不同的筛查方法, 希望在孕期能够尽可能的筛查出该病的高危人群。目前常用的筛查方法为早孕期和中孕期筛查, 即控制检出率达到90.0%, 假阳性率在2.0%～5.0%的情况下, 多采取孕妇年龄、胎儿超声检查结合母体血清学指标综合计算得出相应的结果, 其结果分为低危和高危。对于高危人群, 往往采取绒毛活检或者羊水穿刺取样, 进行胎儿染色体核型分析获得确切的结果明确诊断。但无论何种方法, 侵入性诊断始终存在约0.5%～1.0%的胎儿丢失率。 随着通过母体外周血获取胎儿细胞方法的逐渐成熟, 越来越多的产科医院开始尝试无创的产前诊断方法。自1990年以来, 这项技术被人们不断探索并取得长足进展, 为遗传性疾病的高危人群提供了一种安全的产前诊断方法。该技术本身也存在一定的问题亟待解决, 因此这项技术仍然在不断的完善中, 暂未大规模的应用于临床。本文结合最近一段时间文献相关报道的复习, 对无创性产前诊断技术应用于筛查21-三体综合征的进展进行讨论。 1 无创产前诊断技术的实验室检测方法的进展 1.1 胎儿nrbc的临床意义 由于孕妇外周血中发现了胎儿细胞, 故人们联想到利用孕妇外周血中胎儿细胞诊断胎儿非整倍体异常。如果能够获得完整的胎儿基因组DNA, 则可以进行完整的胎儿染色体核型分析, 从理论上可以作出这样的推断。困难在于, 外周血中发现的胎儿细胞类型多样, 主要有滋养细胞、胎儿有核红细胞 (NRBC) 、淋巴细胞和粒细胞等。相对其他细胞来说, NRBC是单核细胞, 寿命短且稳定, 增殖能力有限, 不滞留到下次妊娠。此外, NRBC有明显的形态学特点和特殊的细胞表面标志物, 易于识别, 因此被认为是理想的无创伤性产前诊断靶细胞。 影响胎儿细胞应用于临床诊断的因素, 首先是获得的胎儿细胞数量太少且存在一定的背景干扰。不但有胎源性, 也有母源性。因此, 在利用NRBC进行无创性产前诊断时, 须对分离到的NRBC来源进行鉴定, 以保证结果的准确性。起初常用的方法为FISH技术 (即原位荧光免疫杂交) 。但人们发现采用FISH方法时, 大多数细胞难以进行荧光标记, 且判读结果依赖于人工, 效率低下, 这些因素都影响了孕妇外周血中胎儿NRBC在产前诊断中的应用。现阶段提出可能的改进方法为寻找新的特异性标记物或改进胎儿细胞的收集方法。可以设想, 如果孕妇外周血中的胎儿细胞能够培养成功, 可以获得足够的应用于核型分析的胎儿细胞, 再结合改进的FISH技术, 如光谱核型分析可能使得非侵入性产前诊断胎儿非整倍体出现突破性进展。 1.2 无创伤性胎儿非整倍体的表观遗传检测 有研究发现怀有染色体非整倍体胎儿的孕妇, 其血浆或血清中胎儿游离DNA浓度高于怀有正常胎儿的孕妇, 但困难的是在孕11～17周, 母体的游离DNA占绝对优势, 使用传统的DNA提取技术和荧光定量聚合酶链式反应 (Polymerase chain reaction, PCR) 方法难以对胎儿染色体非整倍体异常进行准确诊断。解决这一问题的途径, 一种方法是增加提取的胎儿DNA浓度或抑制母体DNA浓度, 减少背景DNA;另一种方法是寻找孕妇外周血中新的胎儿特异性标志物, 使之不受高浓度母体背景DNA的影响。近年来表观遗传学的研究为这一设想提供了可能, DNA甲基化是最早发现也是最重要的基因表观修饰方式之一。DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化调控了基因的表达但并不改变基因的序列。一般情况下, DNA甲基化能关闭某些基因的活性, 去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。2002年Poon等利用甲基化特异性PCR方法, 不仅从母体血浆中检测到了胎儿从父系继承下来的甲基化等位基因, 还检测到从母系继承来的胎儿非甲基化等位基因, 说明胎儿与母体之间的基因位点上存在不同的甲基化形式。这一结果为无创伤性诊断胎儿非整倍体提供了依据。 Chim等的研究显示, 编码maspin基因的SERPINB5基因在胎盘细胞中处于低甲基化, 而在母血细胞中处于高甲基化。因为胎盘是血浆中游离胎儿DNA的主要来源, 而母血细胞是血浆中母体DNA的主要来源。推测利用胎儿和母血细胞之间存在的DNA甲基化状态的差异, 可以进行胎儿非整倍体的检测。唐氏综合征由于其发病率高而备受关注, 为了寻找21号染色体的表观遗传标记, Hulten采取了3种策略进行筛选, 结果在21q22.3发现了3个差异甲基化序列。其中AIRE基因启动子区域的CpG位点高度差异甲基化, 可作为无创性产前诊