无透明带猪体外成熟卵母细胞电激活和无透明带孤雌激活胚胎培养的研究.docxVIP

无透明带猪体外成熟卵母细胞电激活和无透明带孤雌激活胚胎培养的研究 猪体龙科技在药理学中的重要应用是猪体制异质结。猪器官与人器官非常相似。此外，猪的繁殖很快，产了大量的孩子，可以作为异质器官的受害者。传统的核移植是在透明带完整的基础上进行的,而利用传统方法进行核移植研究时,需要昂贵的仪器设备,同时要求操作者掌握熟练的技术,从而限制了核移植研究,特别是其应用的发展。无透明带核移植有独特的优势,不需要昂贵的仪器设备,降低了操作者的劳动强度。有很多因素影响核移植胚的发育,其中一重要环节就是受体卵母细胞的激活。激活处理对胚胎的后期发育非常关键,这也是猪体细胞核移植技术所要解决的难点问题之一。卵母细胞的激活有许多方法,如电激活,钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂激活等。其中电激活是应用最多,也很有效的方法。电激活时由于所用仪器型号和各实验室条件不同,激活条件也各不相同。早期胚胎的体外培养也直接影响胚胎的后期发育,建立无透明带胚胎的培养方式可以为无透明带核移植胚胎的培养搭建平台。Vajta等成功应用无透明带核移植方法获得了体细胞核移植牛,Du等得到手工克隆猪。与此同时,单个胚培养系统及方法获得了很大的发展,如微穴法(Well of the Well,WOW),及GO(the Glass Oviduct System)法,明胶-孔培养法等。其中WOW系统使培养的重构胚囊胚率达50%。到目前为止,去透明带猪卵母细胞电激活和体外培养国内报道极少。该研究旨在优化对去透明带猪卵母细胞的电激活的条件和不同培养方式,对胚胎的附植前发育效率以及囊胚总细胞数进行系统比较研究,期望能找到相对比较适合的去透明带猪体外培养条件,为手工克隆广西巴马小型猪探索条件;探讨猪无透明带孤雌激活胚胎培养体系,为以后HMC(Hand-made Cloning)法猪体细胞克隆技术的进一步研究及应用提供理论依据及实践参考。 1 材料和方法 1.1 材料和实验方法 TCM-199粉剂购自美国 Gibco公司,按说明配制成培养液。其余药品购自美国Sigma公司。配制培养液用水为南宁当地自来水经3次蒸馏,再经Mili-Q过滤,最后经石英蒸馏器蒸馏的超纯水。FSH和LH为中国科学院动物研究所生产。培养液:成熟培养液为改良TCM-199液,胚胎培养液为NCSU-23,洗卵液为TL-Hepes-PVA液,其成分见文献。成熟培养液和胚胎培养液,使用之前在含浓度5%CO2的空气、饱和湿度的39 ℃培养箱中预热平衡4 h以上。洗卵液使用之前在不含CO2的39 ℃恒温箱中预热4 h以上。猪卵母细胞的体外成熟培养条件为39℃,浓度5%CO2空气和相对饱和湿度。电激活所用电融合仪型号为a BTX Electro-cell Manipulator 2001 (BTX,San Diego,CA),融合槽为 BTX microslide 0.5 mm fusion chamber,model 450,cat.no.01-000209-01 ( BTX,San Diego,CA,USA),激活液为浓度0.25 mol/L甘露醇,浓度0.5 mmol/L HEPES,浓度0.1 mmol/L CaCl2·H2O,浓度0.1 mmol/L MgCl2·6H2O,浓度0.01% PVA,调整pH值为7.2～7.4,电激小室两平行电极间距离为0.5 mm。四孔培养皿为NUNC公司生产(丹麦);35 mm 塑料平皿和60 mm 塑料平皿为BD Falcon(USA)产品;胚胎积聚针(BLS aggregation needles DN-10,BLS,Budapest,Hungary)。 1.2 测试方法 1.2.1 卵母细胞的提取 从南宁市屠宰场收集母猪卵巢,置于30～35 ℃左右添加抗菌素的生理盐水中4 h内运回实验室,除卵巢上附着的输卵管等组织,用生理盐水冲洗干净。用带有18号针头的10 ml无菌注射器,抽取直径3～6 mm 卵泡中的卵母细胞,1 h 内抽完。将抽取液缓慢注入置于37 ℃恒温锅的15 ml尖底离心管中,使卵母细胞自然沉降。沉降15 min左右可看到明显的界限,弃上清液,然后将沉淀用洗卵液稀释,在实体显微镜下迅速挑出胞质均匀的且有3层以上完整致密的卵丘细胞包裹的卵母细胞,用洗卵液洗涤2～3 次,再用成熟培养液洗涤3 次后进行成熟培养。 1.2.2 猪卵母细胞的体外成熟培养 实验室在现有条件下改良了TCM-199培养基,添加浓度3.05 mmol/L葡萄糖、浓度0.91 mmol/L丙酮酸钠、浓度1.20 mmol/L半胱氨酸、浓度1.0 μg/ml促卵泡素和促黄体素、浓度10 ng/ml表皮生长因子、浓度75 μg/ml青霉素和浓度60 μg/ml链霉素、浓度10%(体积比)猪卵泡液,用于猪卵母细胞的体