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淀粉酶活力的测定 一、目的 学习和掌握测定淀粉酶（包括a -淀粉酶和6 -淀粉酶）活力的原理和方法。 二、原理 淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本 原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀 粉酶主要包括a -淀粉酶和6 -淀粉酶两种。a -淀粉酶可随机地作用于淀粉中的 a -1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉 的粘度降低，因此又称为液化酶。6 -淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解， 每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使 3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下： 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制 作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位 重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最 强，其中主要是a -淀粉酶和6 -淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，a -淀粉酶不耐 酸，在pH3.6以下迅速钝化。6 -淀粉酶不耐热，在70°C15min钝化。根据它们 的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实 验采用加热的方法钝化6 -淀粉酶，测出a -淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定 淀粉酶总活力（a -淀粉酶活力+6 -淀粉酶活力），再减去a -淀粉酶的活力，就 可求出6 -淀粉酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 实验材料 萌发的小麦种子（芽长约1cm） 仪器 （1）离心机（2）离心管（3）研钵（4）电炉（5）容量瓶:50mLX1, 100mL X1 （6）恒温水浴（7） 20mL具塞刻度试管X 13 （8）试管架 （9）刻度吸 管：2mLX3, 1mLX2, 10mLX1 （10）分光光度计 试剂（均为分析纯） （1） 标准麦芽糖溶液（1mg/mL）:精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解 并定容至100mLo （2） 3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用 蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO进入。若溶液混浊可过滤后使用。 2 （3） 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液 A液：（0.1mol/L柠檬酸）：称取CHO?HO 21.01g，用蒸馏水溶解并定 6 8 7 2 容至1L。 B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取NaCHO - 2H O 29.41g，用蒸馏水溶解 3 6 5 7 2 并定容至1L。 取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。 （4） 1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲 液中。 四、操作步骤 麦芽糖标准曲线的制作 取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂: 试剂 管 号 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液（mL） 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 蒸馏水（mL） 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 麦芽糖含量（mg） 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号 管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标， 光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 淀粉酶液的制备 称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英 砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗 入离心管。提取液在室温下放置提取15?20min，每隔数分钟搅动1次，使其充 分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中， 加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于a-淀粉酶活力测定。 吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇 匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。 2.酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。 酶活力测定取样表 操作项目 a -淀粉酶活力测定 I - 1 I - 2 I - 3 8 -淀粉酶活力测定 II- 4 II- 5 II- 6 淀粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0 0 0 0 钝化8 -淀粉酶 置70°C水浴15min，冷却 淀粉酶稀释液（mL） 0 0 0 1.0 1.0 1.0 3,5-二硝基水杨酸