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ibv国内分离株d971遗传毒性研究 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 中毒产品 荣靖弓等人将以这种方式分离并保存了为此材料的d971株。 1.1.2 f鸡准备 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。 1.1.3 引物的核苷酸序列 参照已发表的IBV 5a、5b与N基因序列保守区设计,由大连宝生物工程有限公司合成,引物的核苷酸序列为:上游引物(P1)5’_TACTTTACCAACAGATCAAA_ 3’,下游引物(P2)5’_GAACCACTTTTACTTGAAAC_ 3’。 1.1.4 载体和革期菌 pMD18_T载体购自宝生物工程(大连)有限公司,受体菌JM83由本实验室保存。 1.1.5 dna片段快速纯化、回收试剂盒 ExTaqDNA聚合酶、限制性核酸内切酶、Marker(DL2000)均购自宝生物工程(大连)有限公司;鼠源反转录酶、RNasin、Trizol RNA提取试剂盒与DNA片段快速纯化/回收试剂盒均购自Gibco BRL公司;其它试剂均为分析纯。 1.1.6 肾型及其组成和生物量 N基因比较时所选毒株及其登录号为Beau:AJ311362(美国呼吸型)、CU_T2:U49858(美国呼吸型变异株)、M41:AJ286184(美国呼吸型)、H52:AF352310(欧洲肾型)、VicS:U52594(澳大利亚肾型)、Ark99:AF43652(美国呼吸型)、SD/97/02:AF221667(中国青岛腺胃型)、X: AY043315(中国浙江肾型)、ZJ971: AF352308(中国浙江腺胃型),HB(中国华北肾型)和DB株(中国东北肾型)序列来自文献;5a和5b基因比较时所选毒株及其登录号为Beau: AJ311362(美国呼吸型)、M41:AJ286184(美国呼吸型)、CU_T2:U46037(美国呼吸型变异株)、SD/97/02:AF221667、DE072:AF203000(美国呼吸型)、D1466:AF203005(美国呼吸型)。 1.2 方法 1.2.1 病毒基因组rna的提取 将IBV国内分离株D971接种10日龄SPF鸡胚,37℃培养48小时后(弃去24小时内的死胚),无菌收集尿囊液,于4℃以4000r/min离心除去杂质,回收上清,再以26000r/min离心2小时后去大部分上清,用剩余的上清重悬尿囊液沉淀,按Trizol试剂盒说明方法提取病毒基因组RNA。 1.2.2 pcr扩增体系 将病毒总RNA与1μl25pM的下游引物P2混合,然后依次加入8μl 5×第一链合成缓冲液、4 μl 2.5mM dNTP、1μl鼠源反转录酶和1μl RNA酶抑制剂,反应体系为40μl。置于37℃水浴2.5小时后,煮沸8分钟,冰浴冷却备用。PCR扩增体系按TaKaRa Ex Taq酶使用说明组成,包括Ex TaqDNA聚合酶1μl,10×PCR缓冲液10μl,2.5mM dNTP 8μl,cDNA模板4μl,上游和下游引物各2μl,灭菌去离子水73μl,总反应体系为100μl。在PE 2400 PCR仪上进行扩增反应,反应热循环参数为:预热95℃5分钟,94℃1分钟,55℃1分钟,72℃2分钟,35个循环后,于72℃再延伸10分钟。扩增结束后取4μl在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳,观察结果。 1.2.3 乳酸菌jm33感受态细胞的构建 将回收后的PCR产物与pMD18_T载体进行连接反应后,转化入大肠杆菌JM83感受态细胞中,筛选阳性菌落于37℃摇菌培养,碱裂解法提取质粒并进行BamHI酶切及PCR扩增鉴定。对鉴定为阳性的重组质粒委托宝生物工程(大连)有限公司进行核苷酸序列测定。 1.2.4 国内分离株d971与国内外毒株的核苷酸检测比较 利用Gene Runner和Dnastar软件,对国内分离株D971与已发表的国内外参考毒株的核苷酸及其推测的氨基酸序列进行分析比较。 2 结果 2.1 d9715a、5b和n基因的克隆 2.2 谷物沉积量的确定 2.3 通过重组颗粒序列测定 2.4 残基同源性分析 2.4.1 D971 5a、5b基因及其推测的氨基酸序列的同源性分析: D9715a基因与Beau、CU_T2、D1466、DE072及SD/97/02毒株的5a基因相比,同源性分别为85.9%、86.4%、87.4%、86.9% 和93.9%,氨基酸序列同源性分别为80.0%、78.5%、83.1%、81.5%和93.8%, 5a区氨基酸共由65个氨基酸残基组成,在第61～64位有一个潜在的N_糖基化位点。D971 5b基因与Beau、CU_T2、D1466、DE072及SD/97/02毒株的5b基因相比,核苷酸序列同源性分别为92% 、92.4%、92.8% 、91.6%和9