高效液相色谱法同时检测红细胞混悬液中硫酸特布他林与盐酸普萘洛尔.docxVIP

高效液相色谱法同时检测红细胞混悬液中硫酸特布他林与盐酸普萘洛尔 1 肾上腺素受体激动剂 受体是存在于膜、细胞浆或内核中的大化合物（例如蛋白质、核酸、脂质等），可以与特定的配体（药物、弹性、激素、内源性活性物质等）结合，产生相关效应。受体上能与配体相结合的活性基团,称为受点或位点。配体与受体结合是药物发挥临床疗效的基础。肾上腺素受体存在于细胞膜,而红细胞膜表面存在特异的肾上腺素β2受体。特布他林是特异性的肾上腺素β2受体激动剂,而普萘洛尔为非选择性肾上腺素β受体的阻断剂,与肾上腺素β2受体亲和力较高。 目前,关于受体与配体的结合情况研究的经典方法是放射性受体配体结合法[1~3],即采用已用放射性元素标记的药物与特异的受体蛋白或者含有某类受体的组织共同作用一段时间后,分离未结合的标记药物,测定受体蛋白或者组织的放射性,从而得出受体配体的结合情况[4~6]。由于放射性元素在检测和后处理时存在环境污染和对人体的伤害。本研究采用对人体无害的兼具有分离与分析功能的高效液相色谱法检测游离药物量。结果表明,特布他林与红细胞膜受体的非特异性结合高于特异性结合量。 2 实验部分 2.1 药品、试剂和工作液的配制 1100高效液相色谱仪(美国Agillent公司),配备荧光检测器。Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm,10μm,大连伊利特分析仪器有限公司)。 甲醇(色谱纯);三乙胺、KH2PO4、H3PO4、Na OH(优级纯);柠檬酸、柠檬酸三钠、葡萄糖、Na Cl(分析纯)。实验用水为超纯水。硫酸特布他林和盐酸普萘洛尔购自中国药品生物制品检定所,分别以超纯水配成1000 mg/L的储备液,临用时根据需要以Alsever液逐级稀释为标准工作液。Alsever液:称取柠檬酸三钠0.80 g,柠檬酸0.05 g,葡萄糖2.05 g,Na Cl 0.42 g,加入超纯水溶解,用H3PO4调至p H 7.40。再加超纯水至100 m L,高温灭菌后置于冰箱中4℃保存备用。 2.2 实验方法 2.2.1 混悬液的制备 将Alsever液混悬的红细胞0.2 m L(含红细胞1.2×1010个)置于2 m LPE管中,分别准确加入普萘洛尔标准工作液与特布他林标准工作液,或者单独加入其中一种药物,然后补加Alsever液至0.5 m L,混匀。将此混悬液置于37℃水浴振荡保温反应1 h,取出,以1500 r/min离心5 min,吸取上清液0.2 m L,于此上清液中加入等体积的甲醇,用于除去其中可能混有的少量蛋白质成分。混悬均匀,13000 r/min离心5 min,取上清液待测。 2.2.2 荧光检测相kh2po Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,10μm);流动相为0.020 mol/L KH2PO4溶液(含0.25%三乙胺,p H 5.1)-甲醇(20∶80,V/V),流速为1.0 m L/min;检测器为荧光检测器,激发波长280 nm,发射波长320 nm;柱温30℃;进样量20μL。 3 结果与讨论 3.1 游离药物的浓度 本实验的目的是测定药物与其特异受体的结合特性,采用正常人体温37℃为反应温度,其达到平衡所需要的时间通过药物与受体的结合程度,也就是含有红细胞膜的Alsever液中游离药物的浓度变化来体现。实验结果表明,保温时间为15,30,60和90 min时,游离药物峰面积分别为6253,5842,5843和5865。由此可见,特布他林与红细胞膜受体的结合随水浴加热时间的延长而增加,但加热到60 min后结合已达平衡,再延长加热时间,结合率并没有明显增加,所以本实验选用加热60 min作为特布他林与红细胞膜受体的反应平衡时间。 3.2 混悬液的加入方法 红细胞膜经过低渗溶液破裂后,用生理盐水洗涤除去水溶性杂质至细胞膜层呈肉红色,同时上清液呈无色,低温冷冻干燥细胞膜。称取干燥后的细胞膜样品5 mg,加入Alsever液200μL,混匀,再分别准确加入普萘洛尔标准工作液与特布他林标准工作液100μL,或者单独加入其中一种药物100μL,然后补加Alsever液至0.5 m L。混匀,将此混悬液置于37℃水浴振荡保温反应1 h,取出,1500 r/min离心5 min,吸取上清液0.2 m L,于此上清液中加入等体积的甲醇,用于除去其中可能混有的少量蛋白质成分,混悬均匀,13000 r/min离心5 min,取上清液待测。将此测定结果与未破裂的完整红细胞同法处理的测定结果进行比较。结果表明,红细胞破裂后所测定得到的非特异结合量明显高于完整红细胞的非特异结合量,而特异结合量则减少。 3.3 色谱柱的制备 药物与细胞膜受体结合形成的复合物为大分子物质,易溶于水而不溶于甲醇等有机溶剂中,而本实验采用的是反相