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一种聚丙烯酰胺胶dna显带方法的改进 通常用于日期显带技术的技术有以下技术：交叉、琼脂酸凝胶电泳和聚吡咯凝胶电泳（页面胶）电泳技术。Southern杂交由于步骤繁琐、耗时长和使用同位素具有放射性污染等缺点,使用较少。琼脂糖凝胶电泳技术以其操作简单、结果获取迅速而被广泛使用,但是同聚丙烯酰胺凝胶相比,琼脂糖凝胶分辨率不高。聚丙烯酰胺凝胶由于其高分辨率,且以银染技术代替了同位素放射性技术,因而广为使用。 1991年,Bassam等提出了PAGE胶显带的常规方法,许多研究者使用了这种方法构建了分子标记连锁图谱。然而,PAGE胶显带的常规方法操作步骤繁琐,耗时长,一些研究者对简化PAGE胶显带的常规步骤进行了有益的探索。 本研究报道了一种PAGE胶常规显带的改进方法,并分别使用改进的显带方法和常规的显带方法进行了PAGE胶显影。同常规的PAGE胶显带方法相比,这种改进的方法具有分辨率更高、步骤少和获取结果迅速的优点。 1 材料和方法 1.1 水稻dna引物的筛选 使用的群体DNA是由珍汕97和HR5衍生的水稻重组自交系群体基因组DNA;引物多态性筛选使用的两个亲本DNA为珍汕97和HR5。引物为水稻SSR的RM系列引物。整个银染和显影过程使用的试剂均为国产分析纯。 1.2 透明胶带封胶胶质胶胶基质原料的改进 使用群体DNA和亲本DNA以及SSR引物进行PCR的反应体系参照王功伟博士毕业论文,而聚丙烯酰胺胶制胶过程略做修改,即不再使用透明胶带封玻璃板,而是直接使用4个铁夹,在玻璃板两边对称各夹两个铁夹,直接进行灌胶。 1.3 垂直板预电泳 将制好的PAGE胶拨出梳子,用自来水彻底冲洗掉胶槽中的碎胶后,固定在垂直板电泳槽上,经预电泳半小时,插上梳子,上样PCR扩增产物5.5μL,进行电泳,电压1 800 V,功率为75 W。电泳45～90 min后,即可下胶。 1.4 显带法 1.4.1 dna带共蒸法 (1)从垂直板电泳槽上,取下PAGE胶板并撬开,将带胶的小玻璃板放入醋酸固定液中,至少固定30min,直到胶面上二甲苯腈和溴酚蓝带完全消失。 固定液配方:即10%的冰醋酸溶液。200 mL冰醋酸;1 800 mL双蒸水,混匀。 (2)从固定液中取出小玻璃板放入双蒸水中,漂洗3次。每次2 min,每次双蒸水用量1 500 mL。 (3)然后在放入0.1%AgNO3中染色30～45 min。 0.1%AgNO3配方:2.0 g硝酸银;2 000 mL双蒸水;3 mL甲醛溶液,充分混匀。 (4)取出银染好的胶,尽可能沥尽上面的硝酸银溶液,随后转入到盛有1 500 mL双蒸水的塑料方盘中,漂洗3～5 s,迅速捞出胶。 (5)取出预冷的显影液,加400μL硫代硫酸钠溶液(10 mg/mL)和3 mL甲醛溶液(37%),充分混匀。随后将漂洗好的胶放入预冷的显影液中,密切观察显影效果和背景的深浅。显影过程中,可以适当摇动。 预冷的显影液配方:60.0 g Na2CO3;2 000 mL双蒸水,充分混匀,随后将装有显影液的容器放入冰水混合物中,预冷显影液至4～5℃。 (6)当DNA带已经清晰显出来后,马上从显影液中取出胶,放入定影液中定影5 min。定影液配方和固定液一样。 从定影液中取出胶,在清水中漂洗3次,洗去胶面上的醋酸和AgNO3溶液,室温晾干即可读胶。 1.4.2 agno3显影液的制备 (1)从垂直板电泳槽上,取下胶板并撬开,将带胶的小玻璃板放入双蒸水(2 000 mL)中漂洗15 s。然后在放入0.1%AgNO3中染色8～10 min。 0.1%AgNO3配方:2.0 g硝酸银;2 000 mL双蒸水,充分混匀。 (2)从0.1%AgNO3取出小玻璃板,再用双蒸水漂洗两次,每次洗10 s。 (3)显影 事先取30.0 g NaOH,加入1 500 mL双蒸水,混匀,制成显影液。将漂洗好的胶放入显影液中,密切观察显影效果和背景的深浅。注意显影时尽量不要摇动,以免PAGE从玻璃面上脱落。 (4)当DNA带已经清晰显出来后,马上从显影液中取出胶,在清水中漂洗2次,洗去胶面上的AgNO3和NaOH溶液,室温晾干即可读胶。 2 引物的引物均为ch33 分别使用常规显影方法和改进方法显影结果如图1。 图1中,A、D、E和F使用的群体DNA扩增的结果,用的引物分别为CH33,RM242、RM1164和RM29;而B和C是对引物多态性的筛选结果。 从图1可以看出,使用常规显带方法显出的图片背景较浅(A和B);而使用改进方法显影的背景较深(D、E和F),为透明的深黄色,但是DNA带和背景对比度明显。因此,使用改进的方法显带完全可以替代常规显带方法。 3 改进的表面显带方法的优越性 显影极为重要的问题就是高分辨率胶图的获得。本实验中,采用常规的显带方法,对于