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枇杷大果型品种远缘种内杂交获得真杂种 许多果树通常是混合繁殖新品种，并根据品种间的陌生种子、去雄和包袋的不及时性造成的。在实际工作中可以利用形态学、细胞学以及分子标记等方法进行杂种苗的鉴定。每种方法各有其优缺点。形态学标记的主要缺点是易受环境条件和发育状态的影响;细胞学鉴定杂种工作量大,也比较烦琐;分子标记技术的发展,为我们提供了从DNA水平即基因水平上来检测种子纯度的有利工具,最终通过电泳图谱检测差异性,其多态性强,准确性高。RAPD标记为显性,对杂种的鉴定可以根据有无父本的特征带或在杂交后代中出现双亲所不具有的条带(即新带型)鉴定其是否杂交成功。根据孟德尔遗传规律,理论上每个标记只能鉴定出50%的杂种,这样标记Ⅰ(50%)十标记Ⅱ(25%)+标记Ⅲ(12.5%)+标记Ⅳ(6.25%)=93.75%,4个标记便可将F1代群体中93.75%的杂种鉴定出来。由于RAPD的显性遗传特点,在用双亲进行引物筛选时无法判断父本特征位点是否为纯合位点,有可能出现母本的显性位点,故分析时必须结合多个RAPD标记(不少于3个)进行分析。新带型是在杂交后代中出现而在双亲中均没有的条带,在真假杂种鉴定时我们直接判断其为真杂种。 宋爱云等利用RAPD技术对香樟6个优选株和2个普通株的遗传多样性进行了分析,确定了它们的遗传关系。刘静等综述了分子标记技术在石斛属植物中的应用研究,认为RAPD是研究石斛属植物的遗传多样性真伪的有效方法。Graham等在分析英、美、荷兰等国家不同育种草莓组培苗时提出:亲本的选配要选择遗传距离较大的材料,才有利于体现杂交优势。RAPD标记被认为是进行枇杷杂种鉴定的一种简单、快速有效的方法。 枇杷属于蔷薇科(Rosaceae)枇杷属(Eriobotrya),种质资源丰富,原产我国的枇杷属植物有21个种(包括5个变种或变型),栽培品种的枇杷为普通枇杷(E.japonica Lindl.),经过长期栽培驯化及选育,形成了许多各具特色的品种。世界上几个主要的枇杷生产规模较大或科研较先进的国家,在品种资源上形成了各自的特色。中国的枇杷品种资源最丰富,有黄肉品种200多个和白肉品种100多个;日本主要是黄肉枇杷品种,不足100个品种,然而杂交育成的品种占有较大比例,品质较好;西班牙也主要是黄肉品种,也不足100个,但西班牙有若干个果实较大的品种,其中3个品种的平均单果质量都超过90 g,其大果性在国际枇杷上独占鳌头。 我们选用我国特早熟优质的早钟6号枇杷和3个大果型西班牙品种杂交,以及用栎叶枇杷和普通枇杷中的解放钟进行远缘杂交,共获得4个杂交组合(ZJ、ZU、ZP和Lj),共计有493株杂种苗,采用RAPD标记对这些杂种苗进行早期鉴定。研究在聚合不同国家枇杷品种的优良特性方面,在远缘杂交创造新种质方面;以及在利用分子标记早期鉴定杂种以期提高枇杷杂交育种的效率等方面,都具有重要意义。 1 材料和方法 1.1 交回收苗确定 2004年12月份进行了普通枇杷种内的3个组合的杂交和栎叶枇杷×普通枇杷1个组合的杂交,杂交按常规方法进行。次春收获种子播种获得杂种苗。杂交的3个群体即早钟6号×西班牙品种Javierin(ZJ)杂种苗共计202株、早钟6号×Ullera(ZU)杂种苗共计94株、早钟6号×Pelluches(ZP)杂种苗共计83株、栎叶枇杷×解放钟(Lj)杂种苗共计114株。 1.2 方法 1.2.1 花粉点的授粉和隔离 杂交选取枇杷盛花期含苞待放的花蕾,每穗留花10~15朵,去除雄蕊,将收集的父本的花粉点在母本的柱头上,授粉后用双层纸袋隔离,待幼果成型去掉外面一层,里面一层保留至果实成熟。 1.2.2 提取枇杷组dna的方法 1.2.3 pcr扩增dntps 参照杨向晖和吴锦程等的方法,25μL的反应体系中,Mg2+为2.0mmol·L-1,酶为1.0 U,引物为0.2μmol·L-1,d NTPS为0.10 mmol·L-1;扩增程序为:94℃5 min(预变性);94℃40 s(变性)→38℃1 min(复性)→72℃1 min(延伸)(45个循环);72℃10 min(后延伸)。 2 结果与分析 2.1 引物筛选及筛选 实验随机选取100条能在枇杷上扩增产生多态性的RAPD引物,进一步对早钟6号、Javierin、Pelluches、Ullera、栎叶枇杷和解放钟6个亲本的基因组DNA进行扩增,经3次重复,筛选出能在Javierin、Pelluches、Ullera和解放钟4个父本中稳定扩增的特征带共计9条引物,引物序列见表1。 2.24 rad扩展模型 2.2.1 利用真杂筛选 从100条RAPD引物中筛选出具有父本Javierin特征带的引物,分别为G16、AB04、AV19、BC20和BE02,进一步对202株早钟6号和