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瑞香狼毒杀虫活性成分的分离与鉴定 狼毒是一种常见的杀螨剂。这是狼毒科植物的一种重要有毒植物，可以为畜牧业的发展和对牧场的保护提供威胁。根据《工农业草经》记载，狼毒与大戟植物狼毒、月腺笔毒、狼毒的联合使用。它的味道又苦又平，而且全面的草毒。它有粘液和水，可以吸收粘液，破坏和杀死昆虫。目前，在国内外对植物中含有的化学成分进行了深入研究和报道。已知其中含有二硫醇、黄酮类、木脂素、香豆素等苯丙素等化合物。蔬菜绿虫是植物粉蝶科的幼虫，属于鳞状粉蝶科，是十字花科的主要害虫。近年来，该实验室对瑞香狼毒的寄生虫活性进行了深入研究。根据对蔬菜绿虫寄生虫活性的初步研究，瑞香狼毒提取的乙醇提取物对蔬菜绿虫具有良好的寄生虫活性。通过对入侵类动物进行接触和抵抗食物的活性测试，作者将瑞香狼毒乙醇提取的活性成分分离并提取，帮助将其转化为危险，并为寄生虫的创造合成模式提供了一个结构模型。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 昆虫的采集和处理 瑞香狼毒根采自四川若尔盖草原. 供试昆虫为3龄菜青虫,采集于未施用农药的甘蓝菜地,于室内饲养12h后,挑选健康且虫体状况大小一致的试虫,饥饿4h供试. 1.1.2 发器及高效液相色谱仪仪 水浴搅拌器:成都科析仪器公司制造;旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂制造;HPLC高效液相色谱仪:美国waters公司制造;层析硅胶板:烟台汇友硅胶开发有限公司制造. 1.2 方法 1.2.1 瑞香狼毒根乙醇提取物的制备 将一定量瑞香狼毒干粉加入10倍量的无水乙醇,常温浸泡24h,45℃水浴搅拌8h,过滤,减压浓缩,得瑞香狼毒根乙醇提取物,即总提取物.总提取物分别用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇萃取. 1.2.2 生物活性测定 填充硅胶H作固定相,干法装柱,洗脱剂用正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷配成,洗脱剂流速为3～4滴/s,分部收集,经薄层层析检测后将Rf值相同者合并.样品在薄层层析板上展开后,用紫外灯和碘粉检测显色,做好标记. 大柱粗分:取正己烷萃取物,用少量正己烷溶解后上样,用正己烷-乙酸乙酯(体积比为20∶1、10∶1、4∶1、2∶1、1∶1)、正己烷-乙酸乙酯-二氯甲烷(体积比为1∶1∶1)梯度洗脱,分三段收集,进行生物活性测定.活性较强部分作为下一步骤起始样品进一步细分. 中柱细分:将活性较高的粗分样品上中柱,用正己烷-乙酸乙酯(体积比为10∶1、4∶1、1∶1)、正己烷-乙酸乙酯-二氯甲烷(体积比为1∶1∶1)、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(体积比为10∶10∶2)梯度洗脱,经薄层层析检测后合并Rf值相同流分,得到三个流分,进行生物活性测定,选择生物活性高的流分,进行下一步柱层析细分. 小柱细分:将活性高的粗分样品上小柱,用正己烷-乙酸乙酯(体积比为4∶1)、二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比为1∶1)梯度洗脱,经薄层层析检测后合并,浓缩得较纯的样品,用于生物活性测定. 1.2.3 菜青虫触杀活性测定 将样品与二甲基亚砜、乳油以1∶1∶2(体积比)的比例,用超声波充分乳化混匀,作为处理液,备用.对照液以双蒸水∶二甲基亚砜∶乳油=1∶1∶2(体积比)的比例配制,备用. 测试萃取物对菜青虫的拒食活性 将新鲜甘蓝叶片用圆形打孔器(直径2cm)打成叶碟,将处理液和对照液按梯度稀释.给处理组中的菜青虫饲喂处理液处理过的叶碟,对照组饲喂对照液处理过的叶碟.选用3龄菜青虫,每组20头虫,重复3次.分别于处理后24h、48h和72h时观察,用坐标纸记录取食面积. 测试萃取物对菜青虫的触杀活性 采用浸虫法,将试虫放于滤网中浸于按梯度稀释的处理液及对照液中,3s后取出,待药液晾干,将试虫放于养虫笼中.均饲喂洁净甘蓝叶片.选用3龄虫,饥饿6h,每组20头虫,重复3次.分别于处理后24h、48h和72h观察,记录死亡情况. 校正死亡率(%)=处理组死亡率?对照组死亡率1?对照组死亡率×100(%)=处理组死亡率-对照组死亡率1-对照组死亡率×100 拒食率(%)=对照组取食面积?处理组取食面积对照组取食面积×100(%)=对照组取食面积-处理组取食面积对照组取食面积×100 2 结果与分析 2.1 正己烷萃取物的急性毒性 以72h后菜青虫的校正死亡率和72h后的非选择性拒食率作为生物活性指标,来评价各萃取物对菜青虫3龄幼虫生物活性的强弱.从表1可以看出,稀释30倍时,正己烷萃取物的校正死亡率为100%,触杀活性的致死中浓度(LC50)是812.1mg/L为最强,甲醇萃取物其次;在测试拒食率的时候,正己烷萃取物的生物活性最强,拒食中浓度(AFC50)是4006mg/L,其次是氯仿萃取物,然后是甲醇萃取物、乙酸乙酯萃取物依次减弱.因此,下一步分离纯化以正己烷萃取物为起点. 2.2 大柱细分流分的生物活性检测 狼毒乙醇提取物的正己烷萃取物经过大柱、中柱、小柱分离