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基于线粒体dna的红麻cob基因克隆与分析 赫布斯是金眼科的一种纤维作物。红麻传统用途是作为纺织及包装原料,其多用途开发还可用于制作纸浆、生物质能源、服饰、饲料、建材等方面。因此红麻被视为2l世纪极具发展潜力的多用途作物。 作物雄性不育性(cytoplasmic male sterility,CMS)机理的研究一直是国内外学者研究的重点和热门领域。CMS也是作物杂种优势利用的主要途径,利用CMS进行杂交制种,可免去人工去雄,节省大量的人力物力,并可提高杂交种子的纯度,增加农作物的产量,已成为国际制种业的主要趋势。1976年Ugale最早报道了红麻细胞质雄性不育现象。2001年,周瑞阳教授首次发现了一株红麻的雄性不育突变体,2004年选育出了第一个CMS系K03A,实现了红麻“三系”配套。但到目前为止,关于红麻细胞质雄性不育分子机理的研究尚未见报道。 大多数研究者认为,线粒体基因组是CMS基因的载体。CMS涉及线粒体基因重排(rearrangement)、编辑(editing)以及突变(mutation)等。线粒体基因的这些改变导致不能形成有功能的蛋白,在花药发育的关键时期阻断了线粒体的功能,因而导致CMS产生。cob基因是线粒体呼吸链第三复合体亚基细胞色素b的编码基因,与线粒体的呼吸代谢功能相关。因此,克隆红麻cob基因并比较其在不育系和保持系中的差异可以在一定程度上揭示红麻CMS的机理,同时也为红麻杂种优势的利用打下基础。 1 材料和方法 1.1 试验材料 红麻不育系品种P3A和保持系品种P3B种子由本课题组率先选育而成。 1.2 igma公司的纺粘设备 酚氯仿、无水乙醇等生化试剂均为分析纯。Jannus Green B试剂盒购自Sigma公司;PfuDNA聚合酶、PstI、Hind III、XhoI、dNTP、DNase、DNA marker 购自TaKaRa公司;Southern blot相关试剂购自Roche公司;引物合成、基因序列测定由上海生工公司完成。 1.3 土地发酵剂检测染色体dna 为避免核基因组和叶绿体基因组DNA的污染,线粒体DNA的提取采取黄化苗为材料。试验用蔗糖密度梯度离心法先分离线粒体,分离的线粒体用Jannus Green B试剂盒检测其纯度和完整性,用蛋白酶K去除蛋白质。再用酚氯仿抽提、乙醇沉淀的方法提取DNA以获取高质量的线粒体DNA。DNA经分光光度计测定浓度和纯度,并经电泳检测完整性。 1.4 杂交曲线及探针pcr扩增 红麻不育系和保持系基因组DNA分别经PstI、Hind III、XhoI彻底酶解后,先进行琼脂糖凝胶电泳和Southern印迹转至尼龙膜上,再经过预杂交、地高辛探针杂交、洗膜、化学荧光检测。 比较保持系和不育系杂交条带的差异。地高辛探针采用随机引物标记的方法进行,探针扩增引物分别是上游cobF1:5′-TGTTCGGTGTCTCGGAGTT-3′;下游cobR1:5′-GGC-ATCGGATTAGCAGGT-3′。具体试验步骤参照High Prime DNA Labeling Kit II(Roche公司)说明书进行。 1.5 pcr扩增及纯化基因表达 以基因组DNA为模板,根据cob基因的保守序列设计引物用,引物序列为上游cobF2:5′-ATGACTATAAGGAACCAACG-3′;下游cobR2:5′-TCAGGTGTGATCAGTCTCAT-3′。PCR扩增采用50 μL反应体系,选用高保真PfuDNA聚合酶,反应液首先加热至95℃并保温5 min,然后开始循环反应:95℃ 45 s;49℃ 45 s;72℃ 90 s;35个循环后,于72℃继续延伸反应10 min。PCR扩增反应时同时设立阴性对照,以蒸馏水为模板。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化、回收得到纯化基因产物。将基因与pMD18-T载体连接,再经过转化感受态细胞、质粒抽提、质粒鉴定,获得的阳性质粒即可进行序列测定。 2 结果 2.1 降清法提取培养实际dna 分析不育系和保持系线粒体基因组DNA的差异,获取高质量的线粒体DNA是关键。本研究用黄化苗为材料,采用蔗糖密度梯度离心的方法,提取到了纯度较高的线粒体DNA。OD260/280值在1.8左右,表明其纯度较高。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳,只有1条大于23 kb的DNA条带,无拖尾现象,表明完整性较好(图1)。可以用于后续的Southern blot分析和基因的克隆。 2.2 诱导探针杂交分析 分别用不同的内切酶酶切红麻保持系和不育系线粒体DNA,电泳后用cob基因特异性片段为进行探针杂交,杂交结果(图2)显示,在不育系和保持系中,其杂交的带型均有差异,说明cob基因在不育系和保持系中的组织形式不同。有可能是通过基因重排和其他的序列形成嵌合基因(ch