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四种丹参药材的体外抗氧化能力比较研究 近年来，根据药理学研究，丹参具有增加冠状动脉血流量、降血脂、抗缺氧、心脏强度、血液流变学、抗心力衰竭、抗心力衰竭等功效。它可以用来治疗各种心脑血管疾病。据研究丹参及其制剂治疗心脑血管疾病的作用与其提取物具有抗氧化活性有关, 通过抑制自由基 (Oxygen Free Radical, OFR) 的产生从而保护心脏免受伤害。随着氧自由基 (OFR) 在疾病中的研究日趋深入, 大量资料证实氧自由基与心血管疾病的发生、发展有着密切关系, 如病毒性心肌炎、克山病、心力衰竭、原发性高血压病、动脉粥样硬化、冠心病、心律失常等。较为一致的观点认为, 由于种种致病因子的作用, 导致OFR蓄集, OFR使细胞膜上的脂质产生过氧化而生成过氧化脂质 (LPO) , LPO进一步损伤心肌细胞膜系统的结构及功能, 而导致细胞死亡。大量研究表明丹参在多方面具有较强的抗氧化活性, 这可能是丹参在治疗活性氧诱发的心脑血管疾病方面效果显著的原因之一。 基于以上研究结果, 本实验首先针对丹参抗心血管疾病活性建立微量、快速的体外抗氧化实验模型。用紫外分光光度法, 定量考察丹参中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和丹酚酸B羟自由基 (·OH) 的清除能力, 为寻找丹参治疗心血管疾病主要活性成分提供依据。 1 材料和机器 1.1 样品和样品溶液的制备 丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸和丹酚酸B由上海中药标准化研究中心提供或自制。分别用双蒸水配制成1 mol/L溶液。 1.2 试剂 30% H2O2、结晶紫、硫酸亚铁购自上海国药集团化学试剂有限公司, 均为分析纯。 1.3 phs-25型酸度计 紫外分光光度计 (TU-1901, 北京普析通用仪器有限公司) , 十万分之一天平 (北京塞多利斯仪器系统有限公司, BT255) , PHS-25型酸度计 (上海精密科学仪器厂) 。 2 方法 2.1 清除羟自由基oh的能力 本实验采用经典Fenton反应。该方法的工作原理: (1) Fenton反应:过氧化氢在Fe2+作用下被还原成羟自由基 (·OH) :Fe2++ H2O2→ Fe3++ OH-+ ·OH; (2) 羟自由基 (·OH) 夺取多元酚类成分的一个氢而被还原:·OH + ArOH → H2O + ArO·; (3) ·OH可以与结晶紫显示剂结合, 使结晶紫褪色, 吸收度降低;当加入抗氧化剂后, ·OH夺取抗氧化剂中的一个氢而被还原, 因此可以抑制结晶紫褪色, 吸收度增强。以高浓度逐渐稀释的方式检测不同浓度样品对羟自由基清除率 (CL) 的影响, 根据公式计算对羟自由基 (·OH) 的清除率, 建立量效关系曲线, 通过量效曲线算出CL为50%时样品的浓度 (IC50) 值, IC50值反映了样品对羟自由基 (·OH) 的清除能力。IC50值越小, 表明样品清除羟自由基 (·OH) 的能力越强。结晶紫溶液:结晶紫4.08 mg, 用重蒸水溶解并定容至50 mL。Tris缓冲溶液 (pH=3.0) :三羟甲基氨基甲烷6.05 g, 加重蒸水溶解后调pH至3.0, 并用水定容至100 mL。硫酸亚铁溶液:硫酸亚铁69.5 mg, 加少量硫酸溶解, 用水定容至100 mL。双氧水溶液:30%H2O21 mL, 用水定容至100 mL。 2.2 羟自由基ac Fenton试剂是以过氧化氢为氧化剂, 以Fe2+为催化体系的氧化法。Fe2+还原H2O2形成羟自由基 (·OH) , ·OH可以和显色剂结晶紫结合, 使结晶紫褪色, 吸收度降低。抗氧化剂可以清除·OH, ·OH对多元酚类成分主要是抽氢反应而被还原, 因此可以减少·OH与结晶紫结合, 所以抑制结晶紫褪色, 吸收度升高。羟自由基的测定:在一系列10 mL容量瓶中分别加入0.6 mL结晶紫溶液、1 mL Tris-HCl溶液、0.5 mL Fe2+溶液和0.5 mL H2O2溶液, 用二次蒸馏水稀释到刻度并摇匀, 放置5 min后, 在波长588 nm处测定光密度D(λ) 值, 计算其余空白参比D(λ)588之差△D(λ) 。羟自由清除率的计算:在上述的体系中, 加入一定量的待测溶液后, 测定体系光密度D(λ)s;未加待测溶液的体系其光密度为D(λ)0;未加Fenton试剂及待测溶液的体系其光密度D(λ) , 则清除率CL按以下公式计算。 CL=D(λ)s?D(λ)0D(λ)?D(λ)0×100%CL=D(λ)s-D(λ)0D(λ)-D(λ)0×100% 3 结果 3.1 检测范围的确定 根据每个样品不同浓度时对以上反应体系吸收强度的影响, 分别对其清除羟自由基的活性进行量效关系分析, 并采用SPSS统计软件对数据进行曲线拟合。数据分析表明, 各样品检测具有一定的浓度范围, 在该范围内样品浓度与自由基