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茯苓及其化学拆分组分抗胃癌和乳腺癌细胞sgc-7501和bcap-37增殖的研究

椰子[racew.）wolf]是多孔细菌科的一种干燥的细菌核。它很甜，很轻，性平，甜，能补充和消除邪气。茯苓主要功效有健脾宁心,渗湿利水,和中益气,助阳。临床常用于治疗水肿痰饮,脾虚便溏,小便不利,健忘,惊悸失眠,心神不安等症。现代药理学研究显示,茯苓多糖有显著抗肿瘤,保肝的活性,并能增强机体免疫功能,但茯苓不同提取物组分对免疫系统和抗肿瘤作用的报道较少。利用MTT法和血清药理学方法对不同剂量的茯苓石油醚、乙酸乙酯、多糖、大孔吸附树脂水洗和醇洗物抗胃癌和乳腺癌活性考查,来探讨对茯苓不同拆分组分的抗肿瘤作用,为进一步研究茯苓的抗肿瘤活性提供科学理论依据。

1设备和材料

1.1作台和稳车器

NU-4750型CO2培养箱:德国NUAIRE公司;HD2-BCN-1360B型生物洁净工作台:哈尔滨东联电子技术开发有限公司;AE31EF型倒置显微镜:MOT-IC公司;SUNRISE酶标仪:瑞士TECAN公司;InnovaU570超低温冰箱-80℃:美国NBS公司;TDZ4-WS低速台式离心机:湘仪离心机;ES-315型内循环灭菌锅:日本Tomy公司。

1.2细胞植物

人胃癌细胞SGC-7901,人乳腺癌细胞Bcap-37,由大连中医医院提供。

1.3患者的酶学质量

FBS:购自GIBCO公司;MEM培养基:购自Thermo公司;双抗:青霉素10000U/mL,链霉素10000μg/mL,Hyclone公司,批号:J120721;胰蛋白酶:GIBCO公司;MTT:GIBCO公司;DMSO:SIGMA公司;PBS磷酸盐缓冲液:石家庄天舜生物。

2方法

2.1小鼠血清中34细胞的传代

人乳腺癌细胞Bcap-37,胃癌细胞SGC-7901分别置于含10%小牛血清和1%双抗的MEM培养基中,5%CO2恒温孵育箱中37℃培养,隔天换液,培养3~4d细胞大约长满整个瓶底70%~80%的程度后1∶2~3传代。

2.2mtt法确定每个药物组的外部细胞生长抑制率

2.2.1萃取物的制备

称取一定量茯苓粉末水煎煮法提取两次,第1次10倍量水加热回流2h,第2次10倍量水加热回流1h,过滤得到茯苓水煎液。80%醇沉两次,沉淀为多糖,醇沉后的上清液浓缩至一倍量,用石油醚和乙酸乙酯萃取8次分别得到石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物,剩下的水层浓缩至一倍量,过大孔吸附树脂柱,用适量水冲洗得到大孔吸附树脂水洗物,适量95%乙醇冲洗得到大孔吸附树脂醇洗物,并用石油醚和乙酸乙酯分别萃取除杂,水层为得到的醇洗物,得到的组分减压干燥。

药物组包括茯苓石油醚萃取物,乙酸乙酯萃取物,茯苓多糖,大孔吸附树脂水洗物,大孔吸附树脂醇洗物,5-Fu阳性对照组(终浓度分别为12.5,25,50,100,200μg/mL),空白对照组(不含药物其他与药物组相同)。

2.2.2复孔复孔复孔

取生长良好的对数生长期细胞,接种于96孔细胞培养板中,每孔100μL(约5000个细胞),每组设3个复孔。培养过夜使细胞贴壁后,换含有不同浓度药物的培养基100μL,37℃培养箱分别培养48h,加5mg/mLMTT10μL/孔,培养4h后换DMSO每孔100μL,震荡使结晶溶解孔内溶液颜色均匀,酶标仪上测定492nm波长下的吸光度OD值,生长抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值×100%。

2.3根据血清药理学，椰子茯苓成分对癌症和乳腺癌细胞的克隆

2.3.1茯苓血清含药血清制备联合用药方案

取健康SD大鼠140只,雌性,适应性饲养1周后,随即分为14组,每组10只,环磷酰胺阳性对照组灌胃30mg/(kg·d),1次/d,茯苓5个组分,每个组分分为低剂量组和高剂量组分别为4.5g/kg和9g/kg(按生药量算),空白对照组灌胃0.4mL含1%吐温-80的蒸馏水,每天早晚各1次,连续3天,共灌胃7次,末次给药1h后眼眶取血,4℃静置2h,3000r/min离心15min分离血清,同组血清混合,56℃灭活,0.22μm滤膜过滤除菌,获得含药血清。

2.3.2dm-so检测细胞生长

取生长良好的对数生长期细胞,接种于96孔细胞培养板中,每孔100μL(约5000个细胞),每组设3个复孔。培养过夜使细胞贴壁后,分别换含有10%不同组含药血清的培养基100μL,37℃培养箱分别培养24h,48h和72h,加5mg/mLMTT10μL/孔,培养4h后培养液换为DM-SO每孔1