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土荆皮乙酸诱导膀胱癌5637细胞凋亡的研究

土荆皮是松科植物的金钱松。代表性成分为土荆棘皮酸和土荆棘皮乙酸钠（pseudobaliac.d.）。PAB是土荆皮主要的生物活性成分,具有抗真菌、抗生育、抗血管生成等作用。近年研究发现,PAB也具有抗肿瘤作用,可以抑制肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病及黑色素瘤等多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡,具有明显的体外抗肿瘤活性,对骨髓、肝、肾等组织毒性低。但其作用靶点、具体机制尚不完全清楚,可能因为细胞类型的不同而存在差异。作者应用MTT法、流式细胞术、Westernblot检测法观察土荆皮乙酸体外抑制5637细胞增殖作用,为探讨土荆皮乙酸的抗癌作用提供实验依据。

1土荆皮乙酸b对k-ras-pab的抑制率

1.1药物与试剂土荆皮乙酸购自中国药品生物制品检定所,批号0880-9901;RPMI-1640培养基(干粉)购自Gibco公司;胎牛血清(四季清);甲基噻唑蓝MTT(Sigma);胰酶(分装)购自Sigma公司;

1.2细胞系及细胞培养5637细胞株购于中科院上海细胞库。采用含10%胎牛血清,青霉素和链霉素各100U·mL-1的PRMI1640培养基,于37℃,5%CO2、饱和湿度培养箱中培养,每48h换液1次,2~3d传代1次。

1.3MTT法检测PAB对5637细胞的生长抑制用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基将对数生长的5637细胞调成1×105个/mL的细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔100μL。实验0.1%DMSO对照组、5637阴性对照组(有细胞但未加药物)及土荆皮乙酸B作用组(浓度为5,10,20,40,80μmol·L-1),各组均设5个复孔,设调零组。分别培养24,48,72h后,每孔加入MTT20μL(5g·L-1),继续培养4h后,弃上清,每孔加入150μLDMSO,酶标仪490nm下检测吸光度(A)。实验重复3次。计算抑制率=(1-A实验组/A对照组)×100%。用直线回归方程求得土荆皮乙酸B分别作用不同时间的半数抑制率IC50。

1.4流式细胞术检测PAB对5637细胞周期及凋亡的影响收集对数生长期的细胞,分别用10,20,40μmol·L-1的PAB处理细胞24h。并设空白对照组。流式细胞仪测细胞周期分布,加AnnexinV-FITC和PI后检测细胞凋亡情况。相同实验均重复3次。

1.5Westernblot分析survivin,caspase-3蛋白质的表达将5637细胞分别与10,20,40μmol·L-1的PAB共孵育24h后,1000r·min-1离心5min(离心半径16cm),收集细胞沉淀,彻底弃上清液,细胞裂解液150μL,获得总蛋白。以牛血清白蛋白(BSA)做对照品,测蛋白浓度。取50μg总蛋白经10%聚丙烯酞胺凝胶电泳分离后,转到硝酸纤维素膜上,5%脱脂牛奶(含0.1%Tween-20)封闭1h,加一抗1∶1000稀释4℃孵育过夜,二抗1∶5000稀释室温孵育2h,4℃孵育过夜(β-actin作为上样量对照),洗膜,ECL法显色后AlphaImager3300型凝胶图像分析仪照相并分析处理。

1.6统计分析用SPSS17.0统计学软件包,计量资料数据以xˉ±sxˉ±s表示,多个样本间比较用单因素方差分析(ANOVA),P0.05有统计学意义。

2结果

2.1小鼠血清中细胞毒作用

MTT结果显示不同浓度PAB(5,10,20,40,80μmol·L-1)作用于细胞后不同时间对5637细胞的增殖均有抑制作用,见图1。细胞毒作用呈明显的时间和剂量依赖性。与对照组相比,DMSO,5μmol·L-1浓度组差异无统计学意义,其余浓度组差异有统计学意义(P0.05)。IC50(24,48,72h)分别为(245.91±20.75),(89.85±13.43),(56.31±2.54)μmol·L-1。三者差异具有统计学意义(P0.05)。根据该试验结果,选取10,20,40μmol·L-1PAB浓度进行进一步试验研究。

2.2pab对g0/3g期细胞增殖的影响

不同浓度PAB(10,20,40μmol·L-1)作用24h后,呈浓度依赖性改变细胞周期分布,一方面降低G0/G1期的细胞比例,另一方面增高G2/M期细胞的比例,提示PAB通过阻滞细胞在G2/M期来抑制5637细胞增殖,同时,细胞的凋亡率呈浓度依赖性增加,与对照组比较差异具有显著性。见表1。

2.3pab对创新小鼠caspase-3表达的影响

用10,20,40μmol·L-1PAB分别作用5637细胞24h,Westernblot检测各浓度组survivin和caspas