H9N2禽流感病毒新型疫苗研制及效果评价.pdf

摘要

自1994年在我国发现H9N2亚型禽流感病毒（Avianinfluenzavirus，AIV）以来，

该病毒长期存在于全国的家禽养殖场中，给我国禽流感防控带来巨大的挑战。免疫接

种是当前防控H9N2亚型禽流感流行的主要手段，但由于病毒的特性以及灭活疫苗的

局限性，使得灭活疫苗的免疫效果不佳。因此，本研究制备了H9N2亚型禽流感病毒

纳米颗粒疫苗与冷适应减毒活疫苗，并评估两种疫苗的免疫效果，旨在为高效H9N2

亚型禽流感疫苗的研制和流感病毒的综合防控提供理论依据和数据支撑。

纳米颗粒疫苗是通过离子凝胶法制备的，壳聚糖为原料，三聚磷酸钠为交联剂，

灭活病毒A/chicken/Qingyuan/141/2020作为抗原。通过优化壳聚糖浓度、三聚磷酸钠

浓度、pH和制备的温度，获得了最优的纳米颗粒疫苗。纳米颗粒疫苗呈规则良好的圆

形，间隔较大，无聚集现象。平均粒径为284.7±10.4nm，PDI为0.211±0.018，Zeta电

位为+33.5±3.6mv，包封率为64.80％±5.4％。纳米颗粒疫苗无细胞毒性，具有良好的

生物安全性和缓释特性，在240h抗原的释放量为88.26％±0.3456％。免疫实验表明：

在免疫后7天、14天、21天和28天，纳米颗粒疫苗组HI（Hemagglutinationinhibition，

HI）滴度分别为：9.3log2、9.5log2、9.1log2和9.4log2；在免疫后21天和28天纳米

颗粒疫苗组淋巴细胞增殖分别是油乳剂灭活疫苗组的1.98倍和1.43倍。免疫保护实

验表明，纳米颗粒疫苗组抑制泄殖腔排毒率为86.3％，而油乳剂疫苗为63.6％；在肺

脏中，纳米颗粒疫苗组病毒滴度显著低于PBS组（1.63vs3.58）（P0.01），在气管中，

纳米颗粒疫苗免疫组病毒滴度显著低于PBS组（2.73vs5.25）（P0.001）。

在冷适应减毒活疫苗研究中，A/chicken/Qingyuan/141/2020为亲本毒株，在MDCK

细胞上连续降温传代，每个温度传代10次。在25℃培养箱纯化10代，获得冷适应毒

株A/chicken/Qingyuan/141-25-ca/2021。在25℃、33℃和41℃分别测定亲本毒株和冷

适应毒株的细胞感染量（TCID50），结果显示CK141-25-ca/21符合商业化冷适应减毒

活疫苗的特性。与亲本毒株相比，冷适应毒株的7个基因发生氨基酸的突变，分别为

M蛋白上的I137T和M244I，NS蛋白上的G153E和D233N，NP蛋白上的Y296C，

HA蛋白上的A213E、P304Q、S336Y、A357G、Y495F和D512E，PB1蛋白上的M155L、

T183A、G232E和M408I，PB2蛋白上的S286G、S474P、R507Q、S593G、E627K、

G671D和S723N，PA上蛋白的V307A、V426D、N497K、V690I和F707L。免疫实验

I

表明，在免疫后7天、14天和21天，冷适应减毒活疫苗组HI滴度分别为9.6log2、

9.7log2和9.9log2；在免疫后7天、14天和21天冷适应减毒活疫苗组淋巴细胞增殖分

别是油乳剂灭活疫苗组的1.46倍、1.24倍和1.68倍。免疫保护实验表明，冷适应减

毒活疫苗组抑制泄殖腔和咽喉排毒率分别为77.3％和88.6％，而油乳剂灭活疫苗组分

别为59.1％和6.8％；在肺脏中，冷适应减毒活疫苗组病毒滴度显著低于PBS组（0.69

vs3.58）（P0.0001），在气管中，冷适应减毒活疫苗组病毒滴度显著低于PBS组（0.69

vs5.25）（P0.0001）。

综上所述，本研究成功制备了禽流感纳米颗粒疫苗和冷适应减毒活疫苗，与油乳

剂灭活疫苗相比，免疫效果大幅提升，为新型高效流感疫苗的研发提供了支持。

关键词：H9N2；纳米颗粒疫苗；冷适应减毒活疫苗；免疫效果评价

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