基因工程菌发酵课件.pptVIP

一、培養罐作為基因重組體的培養裝置，與一直沿用的通氣攪拌培養罐要有區別，即不僅要防止外部微生物侵入罐內，還必須採用不使培養物外漏的培養裝置。按實驗準則，可把這類密閉型通氣攪拌式培養罐劃分為操作液量20L以上和20L以下兩種。現今使用的微生物培養裝置，按其滅菌法又可分兩類。一是在高壓滅菌器中進行培養基及培養罐的滅菌，罐本身通常是玻璃制的，容量在10L以下的居多；另一類是20L以上的培養罐，一般為不銹鋼製品，多採用通新鮮蒸氣進行滅菌。1973年，美國斯坦福大學教授的科恩，從大腸桿菌裏取出了兩種不同的質粒，它們各自具有一個抗藥的基因。科恩把兩種質粒上不同的抗藥基因裁剪下來，再把這兩種基因拼接在同一個質粒中。當這種雜合質粒進入大腸桿菌體後，這些大腸桿菌就能抵抗兩種藥物，而且這種大腸桿菌的後代都具備雙重抗菌性，拉開了基因工程時代的大幕。科恩本人也以DNA重組技術發明人的身份向美國專利局申報了世界上第一個基因工程的技術專利。

基因工程的核心技術是DNA的重組技術，重組即利用供體生物的遺傳物質或人工合成的基因，經過體外或離體的限制酶切割後與適當的載體連接起來形成重組DNA分子，然後在將重組DNA分子導入到受體細胞或受體生物構建轉基因生物，該種生物就可以按人類事先設計好的藍圖表現出另外一種生物的某種性狀。除DNA重組技術外，基因工程還應包括基因的表達技術，基因的突變技術，基因的導入技術等。

*基因工程一般包括四個步驟：一是取得符合人們要求的DNA片段，這種DNA片段被稱為“目的基因”；二是將目的基因與質粒或病毒DNA連接成重組DNA；三是把重組DNA引入某種細胞；四是把目的基因能表達的受體細胞挑選出來。

DNA分子很小，其直徑只有20埃，約相當於五百萬分之一釐米，在它們身上進行“手術”是非常困難的，因此基因工程實際上是一種“超級顯微工程”，對DNA的切割、縫合與轉運，必須有特殊的工具。

要把目的基因從供體DNA長鏈中準確地剪切下來，可不是一件容易的事。1968年，沃納·阿爾伯博士、丹尼爾·內森斯博士和漢密爾·史密斯博士第一次從大腸桿菌中提取出了限制性內切酶，它能夠在DNA上尋找特定的“切點”，認准後將DNA分子的雙鏈交錯地切斷。人們把這種限制性內切酶稱為“分子剪刀”。這種“分子剪刀”可以完整地切下個別基因。自70年代以來，人們已經分離提取了400多種“分子剪刀”。有了形形色色的“分子剪刀”，人們就可以隨心所欲地進行DNA分子長鏈的切割了。

DNA的分子鏈被切開後，還得縫接起來以完成基因的拼接。1976年，科學們在5個實驗室裏幾乎同時發現並提取出一種酶，這種酶可以將兩個DNA片段連接起來，修復好DNA鏈的斷裂口。1974年以後，科學界正式肯定了這一發現，並把這種酶叫作DNA連接酶。從此，DNA連接酶就成了名符其實的“縫合”基因的“分子針線”。只要在用同一種“分子剪刀”剪切的兩種DNA碎片中加上“分子針線”，就會把兩種DNA片段重新連接起來。

把“拼接”好的DNA分子運送到受體細胞中去，必須尋找一種分子小、能自由進出細胞，而且在裝載了外來的DNA片段後仍能照樣複製的運載體。理想的運載體是質粒，因為質粒能自由進出細菌細胞，應當用“分子剪刀”把它切開，再給它安裝上一段外來的DNA片段後，它依然如故地能自我複製。有了限制性內切酶、連接酶及運載體，進行基因工程就可以如願以償了。

運載體將目的基因運到受體細胞是基因工程的最後一步，目的基因的導入過程是肉眼看不到的。因此，要知道導入是否成功，事先應找到特定的標誌。例如我們用一種經過改造的抗四環素質粒PSC100作載體，將一種基因移入自身無抗性的大腸桿菌時，如果基因移入後大腸桿菌不能被四環素殺死，就說明轉入獲得成功了。*前已述及，基因工程細胞培養過程與培養方式與天然細胞培養過程或方式基本—致。但亦有其自身持點。實踐表明，基因工程細胞工業化培養中，產物的產率往往比實驗室培養規模為低。其原因主要與基因工程細胞特點有關，首先基因工程細胞的生長速率及表達率與其所載外源DNA的穩定性及產物分泌過程有關，其中重組DNA的穩定性尤為重要，重組DNA在宿主內表達方式有兩種，其一是游離表達方式、其二是結合表達方式。因此，基因工程細胞培養過程，重組DNA的丟失方式亦有兩種，其一是細胞培養過程，由於回復突變或分配作用致使DNA丟失．稱為脫落性不穩定，其二是重組DNA中編碼的結構基因在宿主內發生再重組過程產生突變，不再表達目的產物，此稱加結構性不穩定。其次為提高基因工程細胞表達效率，需採取適當措施，提高重組DNA在宿主細胞內的拷貝數及促進表達產物自細胞內向細胞外分泌。此外，基因工程細胞的原宿主通常是某些培養物質(如某