劳森菌0004蛋白通过Notch信号通路调控猪肠上皮细胞增殖的研究.pdfVIP

摘要

劳森菌（Lawsoniaintracellularis，LI，又称胞内劳森菌）是一种专性细胞内

寄生菌，世界各地相继报道了关于动物感染劳森菌的病例，我国该病在猪上的阳

性率高达79.1%，造成了巨大的经济损失。近年来，劳森菌感染而引起的猪消化

道疾病明显增加，给养猪业带来了巨大的经济损失，已经成为制约养猪业可持续

发展的重要瓶颈。多项研究显示，溶血素可作为细菌致病的重要毒力因子，在动

物细菌性疾病的发病过程中有不可忽视的作用。然而，劳森菌溶血素A样蛋白

LhlyA（LI0004蛋白）的毒性作用机制未见报道。因此，本研究通过制备LI0004

蛋白多克隆抗体，研究其在检测劳森菌感染中的应用，并以IPEC-J2细胞和小鼠

为模型构建体内外模型，明确LI0004蛋白作为毒力因子在劳森菌感染细胞中的

作用机制，阐明LI0004蛋白在劳森菌感染时调节细胞周期信号通路激活及毒性

作用机制中的作用，为研发抗劳森菌毒力因子的药物提供靶标，进一步为劳森菌

感染的动物疫病防控提供科学依据。本论文开展了以下3方面研究：

1.LI0004蛋白多克隆抗体的制备方法和应用

通过NCBI查找并设计LI0004蛋白引物，PCR扩增目的基因后通过同源重

组连接至表达载体pColdⅠ。获得重组质粒pColdⅠ-LI0004并进行菌落PCR鉴定

和测序分析，将鉴定并测序正确的pColdⅠ-LI0004重组质粒转化至大肠杆菌表达

感受态细胞Rosetta（DE3）中进行诱导表达的IPTG浓度、诱导时间和诱导温度

的优化，并通过蛋白纯化得到纯化的LI0004蛋白。将纯化的融合蛋白免疫大耳

白兔4次（每20天1次），经效价试验、ELISA、抗体纯化、Westernblot检测

等试验获得高效价高纯度的多克隆抗体。结果显示，LI0004蛋白在上清中表达，

且在IPTG浓度为0.1mM、诱导时间为24h、诱导温度为16℃时上清中的表达

量最高。在抗LI0004血清稀释度为1:512000时，样品OD450值/阴性对照OD450

6

值为2.10，抗LI0004血清的效价达1:10。Westernblot试验结果显示，LI0004

蛋白的多克隆抗体可以特异性地与劳森菌总蛋白、LI0004蛋白结合，但在大肠

杆菌（Escherichiacoli，E.coli）总蛋白中，未检测到与其结合的抗原。结果表明

LI0004蛋白的多克隆抗体的特异性良好。此外，应用试验结果显示，劳森菌活

疫苗感染IPEC-J2细胞后，LI0004蛋白主要定位于细胞核、细胞质中，表明以纯

化的LI0004原核蛋白为免疫原制备的多克隆抗体还可以用于劳森菌感染细胞的

免疫荧光分析。

2.LI0004蛋白通过Notch信号通路对IPEC-J2细胞增殖的影响机制研

究

采用IPEC-J2细胞，构建体外劳森菌感染模型，研究LI0004蛋白作为毒力

因子在劳森菌感染细胞中的作用机制，阐明LI0004蛋白在调节细胞周期信号通

路激活及毒性作用机制的关系。首先，用不同浓度的LI0004蛋白孵育IPEC-J2

细胞，确定LI0004蛋白感染IPEC-J2细胞的浓度及其对IPEC-J2细胞增殖的影

响。其次，不同浓度的LI0004蛋白孵育IPEC-J2细胞后，采用Westernblot法检

测IPEC-J2细胞Notch通路以及周期蛋白的表达情况，并通过流式细胞术分析

细胞增殖情况。最后，采用间接免疫双标荧光技术结合免疫共沉淀（Co-IP）试

验及RNA干扰（RNAi）技术进一步分析Notch1在LI0004蛋白引起的IPEC-J2

细胞增殖中的作用机制。结果显示，0.02、0.04和0.08mg/mL的LI0004蛋白孵

育IPEC-J2细胞24h后，提取细胞总蛋白，通过Westernblot试验检测到了LI0004

蛋白，且随孵育剂量的增加而增加，说明LI0004蛋白可进入IPEC-J2细胞而发

挥作用。CCK8细胞活力试验结果显示，0.02、0.04和0.08mg/mL的LI0004蛋

白呈剂量依赖性的促进IPEC-J2细胞的增殖