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生物化工工艺学实验教程（最新版，附菌种培养）

主编：生物化工教学研究组

版本：2025修订版

适用对象：生物工程、生物化工专业本科及研究生

配套课程：生物工艺学、发酵工程、生物分离工程

前言

本教程基于《生物工艺学实验》教学大纲核心要求，整合近5年工业生物技术突破（如合成生物学改造菌种、无甲醇蛋白表达）与实验室标准化操作规范，旨在培养学生“菌种构建-发酵控制-产物纯化-数据分析”全链条实验能力。教程特色如下：

前沿性：纳入中科院天津工生所L-苹果酸发酵、江南大学毕赤酵母蛋白表达等2024-2025年最新成果；

实用性：附3套工业级菌种培养方案（霉菌、酵母、细菌）及15种常见故障解决方案；

规范性：严格遵循《生化药品制造工安全技术操作规程》，强化实验安全与数据溯源。

本教程可作为必修课实验指导书，亦适用于生物制药、食品发酵等领域技术人员培训。

第一部分实验基础与安全规范（约2000字）

第一章实验核心原理

1.1生物化工工艺体系构成

生物化工实验涵盖三大核心环节：

菌种工程：通过诱变、基因编辑等技术改造微生物，如代谢工程改造毕赤酵母实现无甲醇蛋白生产；

发酵工程：控制温度、pH、通气量等参数优化产物合成，典型案例包括黑曲霉柠檬酸发酵、嗜热真菌生物质发酵产苹果酸；

分离工程：采用离心、层析、结晶等技术纯化产物，如离子交换层析分离柠檬酸、膜分离回收重组蛋白。

1.2关键技术原理

无菌操作：通过超净台、灭菌锅建立局部无菌环境，核心是阻断杂菌污染路径（详见2.2节）；

代谢调控：通过碳氮比调控（如葡萄糖-玉米浆配比）、诱导剂选择（乙醇替代甲醇）优化产物合成；

分离纯化：基于分子大小（凝胶层析）、电荷差异（离子交换）、亲和作用（抗体层析）实现产物富集。

第二章实验室安全操作规范

2.1个人防护要求

强制防护装备：实验服（防静电材质）、耐酸碱手套（接触强酸强碱时需双层佩戴）、护目镜（离心操作必戴），高毒实验需加戴防毒面具；

禁忌行为：操作区域禁止饮食、佩戴饰品，长发需束入帽内，严禁用手直接接触菌种及发酵液。

2.2设备安全操作

设备名称

操作禁忌

应急处理

高压灭菌锅

超压（121℃/0.1MPa）、未排冷空气

立即断电，缓慢泄压，禁止直接开盖

生物安全柜

运行时打开前窗、放置非无菌物品

风速异常立即停机，紫外消毒30分钟

高速离心机

不平衡装载（误差0.1g）、盖门未锁

紧急制动，待完全停转后开盖检查

2.3应急处置预案

化学泄漏：酸液泄漏用碳酸氢钠粉末覆盖，碱液泄漏用硼酸中和，再用吸水棉转移至危险品回收桶；

生物污染：菌种洒溢立即用75%乙醇喷洒，覆盖无菌纱布10分钟后清理，操作人员需更换实验服并洗手消毒；

火灾事故：有机溶剂火灾用二氧化碳灭火器，电器火灾先断电再用干粉灭火器，禁止用水扑救。

第三章实验数据处理方法

3.1数据记录规范

采用三线表格记录原始数据，注明实验日期、温度、设备型号；

异常数据需标注原因（如“pH突降，疑灭菌不彻底”），不得随意涂改。

3.2统计分析工具

Excel：用于数据整理（均值、标准差计算）及绘制折线图（如发酵过程OD600变化）；

Origin：拟合发酵动力学曲线（如Logistic模型拟合菌体生长）；

SPSS：进行正交实验方差分析，筛选最优工艺参数（详见实验四）。

第二部分核心实验模块（约8000字）

实验一黑曲霉发酵生产柠檬酸（基础型）

一、实验目的

掌握霉菌斜面菌种制备及摇瓶发酵操作；

探究温度、pH对柠檬酸产量的影响；

学会用滴定法测定柠檬酸浓度。

二、实验原理

黑曲霉在酸性条件（pH2.0-3.0）下，通过EMP途径将葡萄糖转化为丙酮酸，经羧化生成草酰乙酸，最终还原为柠檬酸。过量葡萄糖与低氮源环境可抑制柠檬酸降解酶活性，促进产物积累。

三、实验材料

菌种：黑曲霉CICC2013（中国工业微生物菌种保藏中心）；

培养基：

斜面培养基：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，pH自然；

发酵培养基：葡萄糖150g/L、(NH4)2SO42g/L、KH2PO41g/L、MgSO4?7H2O0.5g/L，pH2.5；

设备：超净台、恒温培养箱（28℃）、摇床（200r/min）、滴定管。

四、实验步骤

菌种活化（第1天）

在超净台内，用无菌接种环挑取斜面菌种，划线接种至新斜面培养基，28℃培养7天，至斜面长满绿色孢子；

检查菌种纯度：显微镜观察无杂菌菌丝（黑曲霉菌丝具分隔，顶端有孢子囊）。

种子液制备（第8天）

无菌操作下，用5mL生理盐水冲洗斜面孢子，制成孢子悬液（浓度10^6个/mL）；

取1mL悬液接入装有