NtME1和NtME2基因在烟草小孢子胚胎发生中的功能研究.pdfVIP

NtME1和NtME2基因在烟草

小孢子胚胎发生中的功能研究

摘要

在自然情况下，高等植物的小孢子将发育成为雄配子体，即花粉。在体外特定培养

条件下，小孢子可以改变其发育命运，从配子体发育途径转向孢子体发育途径，胚胎会

不断的进行分裂，最终形成成熟的子叶胚并发育成为完整的植株，这一过程即为小孢子

胚胎发生。通过植物小孢子胚胎发生实现单倍体和双单倍体植株的快速获得，是近年来

育种上研究的热点，但这一技术背后的分子机制仍尚不明确。本论文通过本课题组前期

未发表的烟草小孢子胚胎发生转录组数据库筛选，寻找到两个小孢子胚胎发生特异转录

因子基因NtME1（Microsporeembryogenesis1）和NtME2（Microsporeembryogenesis2）,

并通过分子生物学、细胞学和遗传学等手段进行功能分析，详细研究了NtME1和NtME2

基因在烟草小孢子胚胎发生中的功能和作用机制。主要研究结果如下：

1.筛选获得小孢子胚胎发生特异性的转录因子基因NtME1和NtME2。利用本实验室

小孢子配子体发育途径和孢子体发育途径转录组数据库中进行差减分析，筛选得到了小

孢子胚胎特异性的转录因子基因NtME1和NtME2，并通过RT-qPCR验证其只在孢子体

途径表达，配子体途径不表达。

2.创建了烟草NtME1和NtME2基因的小孢子异位表达株系。利用小孢子特异性基

因MicrosporeSpecificGene（NtMSG）启动子构建异位表达载体pNtMSG::NtME1/2-GFP，

采用叶盘法转基因，分别获得转基因植株63株和70株。利用GFP荧光标签和RT-qPCR

检测NtMEs基因的表达水平，筛选T代纯合植株。

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3.异位表达NtME1或NtME2基因可以促进烟草小孢子胚胎发生。野生型烟草小孢

子需要先经过胁迫处理5天后转入营养培养基中继续培养才能启动分裂，但是当异位表

达NtME1和NtME2后，既提高了小孢子胚胎发生比率又促进了小孢子胚胎发生提前。

4.NtME1和NtME2基因通过调控脂质代谢来参与小孢子胚胎发生。尼罗红染色显

示在单核靠边期小孢子进行饥饿培养第0、1、3天时显示了相对均匀的红色信号，没有

明显的变化。野生型植株小孢子在转入营养培养第5天时才开始出现脂质滴的积累，而

转基因植株小孢子在胁迫培养第5天时就观测到了脂质积累信号。

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5.NtME1和NtME2基因通过调控内膜系统重建来参与小孢子胚胎发生。在小孢子

进行饥饿培养第0、1、3天时细胞内质网结构显示均匀的绿色荧光，边缘清晰，内质网

网络相对完整，无明显聚集或断裂。当饥饿培养第5天时，野生型小孢子与之前相比依

然没有明显的变化，而转基因植株的小孢子细胞中内质网信号有明显增强，显示出更加

密集和不规则的荧光，说明内膜系统进行了重构。

6.ChIP（chromatinimmunoprecipitation）-seq分析显示NtME1基因下游通路主要

与转录调控和能量代谢有关。对pNtMSG::NtME1-GFP株系进行ChIP-seq分析，发现其

下游KEGG通路主要富集在RNA聚合酶、氧化磷酸化以及卟啉和叶绿素代谢等与转录

调控和能量代谢有关的过程中。下游基因启动子Motif分析筛选。ChIP-seq筛选到候选

下游基因，根据启动子motif分析，找到了关键的基因序列。这些基序为后续进行基因

的下游靶标验证提供关键数据支持。

综上所述，我们研究了特异转录因子NtME1和NtME2基因在小孢子发育调控中的

功能和作用机制，我们发现NtME1和NtME2基因能够影响小孢子胚胎发生，显著的提

高小孢子胚胎发生比率并促使小孢子胚胎发生提前。NtME1和NtME2基因通过调控脂

质代谢和内膜系统的重建来参与小孢子胚胎发生。通过ChIP-seq发现NtME1基因可能

通过激活或抑制特定的下游基因或信号通路来发挥作用，能够解释小孢子胚胎发生的调

控机制。

【关键词】：烟草；小孢子；小孢子胚胎发生；转录因子

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ThefunctionofNtME1andN