DB22-T 1617-2012 饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的测定液相色谱-质谱-质谱法.docxVIP

DB22T饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的测定液相色谱质谱质谱法

1范围

本标准规定了饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量的液相色谱质谱质谱测定方法。

本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量的测定。

本标准的方法检出限：孔雀石绿和结晶紫为0.5μg/kg，隐色孔雀石绿和隐色结晶紫为1.0μg/kg。

2原理

试样中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫用乙腈乙酸铵缓冲溶液提取，经HLB固相萃取柱净化，采用液相色谱质谱质谱法测定，外标法定量。

孔雀石绿和结晶紫在酸性条件下易转化为其隐色形式，因此在样品前处理过程中需控制pH值，防止目标物转化。提取液经HLB固相萃取柱净化后，可有效去除饲料基质中的干扰物质，提高检测灵敏度和准确性。

3试剂和材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

3.1乙腈：色谱纯。

3.2甲醇：色谱纯。

3.3乙酸铵：色谱纯。

3.4甲酸：色谱纯。

3.5乙酸铵缓冲溶液（0.1mol/L）：称取7.71g乙酸铵，用水溶解并定容至1000mL，混匀。

3.6乙腈乙酸铵缓冲溶液（90+10，V/V）：量取90mL乙腈和10mL乙酸铵缓冲溶液（3.5），混匀。

3.7甲酸水溶液（0.1%）：量取1mL甲酸，用水稀释并定容至1000mL，混匀。

3.9标准储备溶液（100mg/L）：分别准确称取10.0mg（精确至0.1mg）孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准品，用乙腈溶解并定容至100mL，配制成浓度为100mg/L的标准储备溶液，于18℃避光保存，有效期3个月。

3.10混合标准中间溶液（1mg/L）：分别吸取1.00mL孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准储备溶液（3.9）于100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为1mg/L的混合标准中间溶液，于4℃避光保存，有效期1个月。

3.12HLB固相萃取柱：200mg/6mL，或相当者。

3.13微孔滤膜：0.22μm，有机相。

4仪器和设备

4.1液相色谱质谱质谱联用仪：配电喷雾离子源（ESI）。

4.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。

4.3离心机：转速≥10000r/min。

4.4涡旋混合器。

4.5超声波清洗器。

4.6氮吹仪。

4.7固相萃取装置。

4.8pH计：精度±0.02。

4.9组织匀浆机：转速≥10000r/min。

4.10离心管：50mL，聚丙烯。

4.11容量瓶：10mL、25mL、50mL、100mL。

4.12移液器：10μL、100μL、1000μL、5000μL。

5试样制备与保存

5.1试样制备

取具有代表性的饲料样品约500g，用组织匀浆机充分粉碎混匀，装入洁净容器中，密封备用。

5.2试样保存

6分析步骤

6.1提取

称取5.0g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入20mL乙腈乙酸铵缓冲溶液（3.6），涡旋混合2min，超声提取15min，以10000r/min离心10min。将上清液转移至另一50mL离心管中，残渣再加入20mL乙腈乙酸铵缓冲溶液（3.6），重复提取一次，合并上清液。

6.2净化

6.2.1HLB固相萃取柱活化：依次用5mL甲醇和5mL水活化HLB固相萃取柱，保持柱体湿润。

6.2.2上样：将6.1中得到的提取液以约1mL/min的流速通过HLB固相萃取柱。

6.2.3淋洗：用5mL水淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液。

6.2.4洗脱：用5mL甲醇洗脱目标物，收集洗脱液于10mL离心管中。

6.2.5浓缩：将洗脱液在40℃水浴中用氮吹仪吹至近干，用1.0mL乙腈乙酸铵缓冲溶液（3.6）溶解残渣，涡旋混合1min，经0.22μm微孔滤膜过滤，供液相色谱质谱质谱测定。

6.3测定

a)色谱柱：C18柱，2.1mm×100mm，1.7μm，或相当者；

b)流动相：A为甲酸水溶液（0.1%），B为乙腈；

c)梯度洗脱程序：0min时B为20%，0min~5min时B由20%线性变化至95%，5min~7min时B保持95%，7min~7.1min时B由95%线性变化至20%，7.1min~10min时B保持20%；

d)流速：0.3mL/min；

e)柱温：40℃；

f)进样量：5μL。

a)离子源：电喷雾离子源（ESI）；

b)扫描方式：正离子扫描；

c)检测方式：多反应监测（MRM）；

d)毛细管电压：3.5kV；

e)离子源温度：150℃；

f)脱溶剂气温度：500℃；

g)脱溶剂气流速：800L/h