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百日咳实验室检测技术指南

百日咳是由百日咳鲍特菌（Bordetellapertussis）引起的急性呼吸道传染病，实验室检测是确诊和流行病学调查的关键环节。目前常用的检测技术包括细菌分离培养、直接荧光抗体检测（DFA）、分子生物学检测（以PCR为主）及血清学检测四大类，各类技术在适用场景、操作规范及结果判读上存在差异，需根据样本类型、病程阶段及临床需求选择合适方法。

一、细菌分离培养技术

细菌培养是百日咳诊断的“金标准”，适用于病程早期（卡他期至痉咳期前2周）未使用抗生素的患者样本检测。

（一）样本采集与处理

1.采样方法：首选鼻咽拭子采样，使用无菌涤纶或藻酸钙拭子（避免棉拭子，因棉纤维可能抑制细菌生长），经鼻孔缓慢插入至鼻咽后壁（深度约为患者鼻翼至外耳道口距离的2/3），旋转拭子并停留10-15秒后取出。也可采用咳碟法（将鲍-金培养基平皿置于患者口前5-10cm处，令其连续咳嗽5-10声后立即盖好平皿），但阳性率低于鼻咽拭子。

2.样本保存与运输：拭子采集后需立即接种培养基，若无法及时处理，应将拭子插入含半固体运输培养基（如Amies培养基）的试管中，4℃保存并24小时内送检；超过24小时需-70℃冻存（避免反复冻融）。

（二）培养基选择与培养条件

1.培养基：推荐使用鲍-金培养基（Bordet-Gengouagar，含15%-20%脱纤维羊血及甘油）或雷氏培养基（Regan-Loweagar，含活性炭、马血及头孢他啶等抗生素抑制杂菌）。雷氏培养基因添加抗生素，更适用于已使用抗生素患者的样本培养。

2.接种与培养：将拭子在培养基表面做“Z”字形涂抹，分区划线分离单菌落。置于35-37℃、5%-10%CO?环境中需氧培养（可用烛缸法维持CO?浓度），培养时间5-7天（部分菌株需延长至10天）。

（三）菌落鉴定

1.形态观察：培养48小时后可见针尖大小、光滑湿润、珍珠样半透明菌落，周围有狭窄溶血环（鲍-金培养基更明显）；72小时后菌落直径约1-2mm，呈银灰色“水银滴”样。

2.染色与生化反应：挑取可疑菌落进行革兰染色，可见革兰阴性短小杆菌（0.2-0.5μm×0.5-2.0μm），常单个或成对排列。生化鉴定需检测氧化酶（阳性）、触酶（阳性）、尿素酶（阴性）、硝酸盐还原（阴性）及动力（无）等指标。

3.血清学确认：使用百日咳鲍特菌特异性抗血清（如因子血清1、2、3）进行玻片凝集试验，阳性反应表现为快速（1分钟内）凝集。

（四）注意事项

-采样应在患者使用抗生素前完成，抗生素治疗48小时后培养阳性率显著下降。

-培养基需新鲜配制（鲍-金培养基4℃保存不超过7天，雷氏培养基不超过14天），避免营养成分流失或杂菌污染。

-培养环境需严格控制温度和湿度（相对湿度60%-80%），避免培养基干裂影响细菌生长。

二、直接荧光抗体检测（DFA）

DFA通过荧光标记的特异性抗体与样本中的百日咳鲍特菌抗原结合，经荧光显微镜观察结果，适用于快速初步筛查。

（一）操作流程

1.样本处理：将鼻咽拭子在生理盐水中充分洗脱，取10μl洗脱液均匀涂片于载玻片（直径约1cm），自然干燥后用无水乙醇固定10分钟。

2.荧光染色：滴加1:10-1:20稀释的荧光标记抗百日咳鲍特菌单克隆抗体工作液（覆盖涂片区域），置湿盒中37℃孵育30分钟。

3.洗涤与封片：用0.01mol/LPBS（pH7.4）轻轻冲洗玻片3次（每次5分钟），吸水纸吸去多余液体，滴加抗荧光淬灭封片剂，加盖玻片。

4.镜检判读：在荧光显微镜（激发光490nm，发射光520nm）下观察，阳性结果可见散在或成簇的亮绿色荧光杆菌（形态为球杆状，两端钝圆），每视野≥10个典型菌可判为阳性。

（二）性能特点

-优点：操作快速（2-3小时出结果），适用于急性期样本的快速筛查。

-缺点：特异性受样本中杂菌（如嗜血杆菌、假单胞菌）交叉反应影响，需结合培养或PCR结果确认；灵敏度低于培养（约60%-80%），尤其在病程后期或抗生素使用后易漏检。

（三）质量控制

-每次检测需设置阳性对照（已知百日咳鲍特菌培养物涂片）和阴性对照（健康人鼻咽拭子涂片），确保试剂有效性。

-涂片厚度需均匀，过厚可能导致背景荧光增强，影响判读。

三、分子生物学检测（PCR技术）

PCR因高灵敏度和特异性，已成为百日咳实验室诊断的核心技术，适用于各病程阶段（包括抗生素使用后、培养阴性或病程超过2周的患者）。

（一）靶基因选择

推荐选择双重靶标以提高特异性：

1.IS481插入序列：为百日咳鲍特菌的特异性重复序列（拷贝数约20-30个/基因组），