LvYY1介导的WSSV+ie1启动子激活在杆状病毒表达禽流感HA中的应用.pdfVIP

第四章LvYY1激活WSSVie1对抗原表达提升的评价41

1.材料41

1.1质粒、菌株、细胞41

1.2主要试剂42

1.3主要仪器42

2.方法42

2.1设计引物42

2.2EGFP、HA目的基因扩增及纯化42

2.3重组质粒的构建以及鉴定43

2.4重组杆状病毒的制备以及鉴定44

3.结果46

3.1EGFP、HA真核表达载体构建图示47

3.2目的基因扩增以及菌液PCR结果47

3.3EGFP目的蛋白荧光鉴定和WB鉴定48

3.4HA目的蛋白血凝鉴定49

4.讨论50

第五章BV-LvYY1-ie1-HA的转导效力和免疫原性分析52

1.材料52

1.1病毒、细胞、实验动物52

1.2试剂53

1.3仪器53

2.方法53

2.1鸡成纤维细胞的分离与培养53

2.2转导实验54

2.3动物免疫实验55

2.4血凝抑制实验55

2.5ELISA实验56

2.6IL-4、IFN-γ测定实验56

3.结果57

3.1鸡成纤维细胞分离及培养57

3.2转导效率检测57

3.3特异性抗体检测58

3.4抗病毒检测59

3.5体液免疫检测59

4.讨论61

全文总结62

创新点63

展望64

参考文献65

致谢71

摘要

杆状病毒表达系统（Baculovirusexpressionvectorsystem，BEVS）是一种真

核表达系统，经过30年的发展，因为其优越性能已经成为生产重组蛋白和疫苗

的最佳优选平台之一。然而，对于某些抗原，杆状病毒表达系统的缺点是生产的

外源蛋白产量低，这增加了疫苗生产成本，也限制了BEVS的开发与应用。

因此，为了优化杆状病毒表达体系，本试验开展了以下研究内容：1）探究

在BEVS中对虾白斑综合症病毒的早期启动子（WhiteSpotSyndromeVirus

ImmediateEarlyGenepromoter，WSSVie1）和南美对虾YY1蛋白（Litopenaeus

VannameiYinYang1，LvYY1）二者关系；2）以增强型荧光蛋白（EnhancedGreen

FluorescentProtein，EGFP）报告基因鉴定转录增强元件LvYY1对WSSVie1启

动子的作用；3）以禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus，AIV）为模型在实验动物

中探究了新型杆状病毒载体疫苗的免疫优化效果。

1.LvYY1蛋白在杆状病毒系统中的表达及其与WSSVie1启动子的相互作用

将在生物公司合成的LvYY1-Flag基因序列插入pOET5载体的Ppolh启动子

下游，获得重组质粒pOET5-LvYY1-Flag。将重组转移载体和Bsu36I酶切获得线

性化杆粒共转染获得第1代（P1）重组杆状病毒BV-LvYY1-Flag。三代传毒后收

取重组蛋白，通过Westernblot分析蛋白的大小。结果表明，LvYY1在Sf-9细胞

中得到了有效的表达，大小是60kDa左右。IFA实验证实LvYY1蛋白的表达主

要定位于细胞核中。

为了证实LvYY1是否为WSSVie1