复旦 生物大分子bio-coures-3.pptVIP

载体功能基团的活化方法：载体分子结构要具有能与间隔臂和配位基进行化学反应的活性基团，或可以选用合适的活化试剂对载体基质进行化学改性。亲和介质的活化方法主要有：溴化氰法：利用含邻位羟基的介质与CNBr在碱性条件下反应环氧法：活化效率高（如表氯醇、双环氧基团）碳二亚胺（R1NCNR2）法：主要与介质的羧基反应对不耐碱的介质比较有利另外，羰基二咪唑法、三嗪活化法、戊二醛法、亚硫酰氯法等间隔臂：减弱生物大分子与亲和配基活性位接近时的空间位阻作用商振华等发现在去除内毒素的实验中，当间隔臂长度增加2.28nm时，内毒素的去除率从未接间隔臂时的40％升至90％理想的间隔臂要求：合适的长度（太长则会封闭相邻的活性位而同样引起空间位阻），无活性吸附位，必须具有两个官能团，分别与基质和配基反应。常用：二胺类、多肽、氨基酸类等亲和配基:酶的抑制剂抗体A蛋白凝集素（lectin）辅酶三嗪类色素过渡金属离子组氨酸肝素测定方法：一般说来，单位质量介质上固载化配基含量越高、越均匀，纯化分离所得产品含量也越高。元素分析法光谱分析高效液相色谱法（HPLC）:测定固载化前后配基样品溶液浓度的改变来确定质上固载化配基的含量酸碱滴定法放射性标记和免疫测定法固定化金属螯合亲和层析（IMAC）和亲硫吸附层析（TAC）是假生物特异亲和层析的重要例子和应用固定化金属螯合亲和层析：这种高效纯化方法的基础是共价结合在层析载体上的金属离子螯合剂能与表面含有组氨酸残基的蛋白质相互作用。FractogelEMD是选用亚氨基二乙酸作为金属螯合配体，其两个齿状螯合部分在固定化后仍保持自由状态，因而各种金属离子就能结合到静止相上，而特殊的蛋白质或肽就能通过金属离子的自由配位位点结合上去。亚氨基二乙酸是以共价形式高密度地固定在连接臂上，从而保证了高度的亲水性、柔性和结合容量，使金属离子更容易结合在蛋白质表面的结合位点上，有利于络合物的形成，并使蛋白质十分牢固地结合在FractogelEMD螯合介质上。当然，蛋白质表面组氨酸残基的结合能力，对于结合蛋白质也十分重要。对肽来说，?-氨基也能起到决定性的作用，即使没有组氨酸残基存在也能滞留多肽。也有报道认为，其它结合金属的氨基酸，如半胱氨酸和色氨酸也对蛋白质的螯合有作用。IMAC的优点:与真正的生物专一性亲和层析相比，IMAC操作更容易、更快速。IMAC除了广泛的用途和较低的价格外，还具有能与高盐浓度缓冲液相匹配的优点，所以从离子交换介质上收集下来含有高盐浓度的组分，可以直接上金属螯合亲和柱。在多数情况下，能避免在上柱前对样品进行更换缓冲液或透析等耗时操作。另外，不同的金属离子都能够络合到柱子上，这样相同的吸附剂就能产生不同的吸附选择性。一般来讲，结合蛋白质能力最强的是铜离子，其次是镍离子，而锌离子和钴离子结合力较弱。固定化金属螯合亲和层析实例IDA-Cu(II)柱上的肽层析图谱。将神经降压素、舒缓激肽、生长激素释放抑制因子、血管紧张素和铃蟾肽混合物上样于螯合有Cu(II)的IDA-FractogelEMD螯合柱。用0.02mol/LNaCl(pH7.0)的缓冲液平衡柱，洗柱之后用0.1mol/L磷酸钠，1mol/LNaCl(pH3.8)在流速为1mL/min下进行pH梯度洗脱。神经降压素(峰1)与柱不结合，在洗涤步骤中即被洗下；具有最强结合力的为含有组氨酸的铃蟾肽(峰4)和血管紧张素III(峰5)。含有丝氨酸的舒缓激肽(峰2)和生长激素释放抑制因子(峰3)表现出较弱的亲和力。亲硫吸附层析（TAC）亲硫吸附层析:这类高效的假生物特异性亲和层折是基于盐驱动吸附原理，将蛋白质（特别是抗体）吸附到含有砜基和硫醚基的杂脂肪族配体上。蛋白质的吸附作用主要是通过对色氨酸和苯丙氨酸残基的作用发生在抗体分子保守区中结构域上，因此，含有所谓亲硫区的蛋白质，如免疫球蛋白和含有芳香族氨基酸残基的肽最适于TAC纯化。由于白蛋白不能吸附在亲硫介质上，因而大大简化了从血清中高效分离抗体。根据最近的研究结果，采用亲硫吸附技术成功地实现了对大肠杆菌(E.coli)表达的重组单链抗体片段的有效纯化，用这种方法对其他在表面上带有亲硫区的蛋白质和肽的分离纯化结果也已有报道。TAC的优点：对于抗体的纯化来讲，TAC纯化的最大优点是配体的