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蛋白质的化学修饰化学修饰的主要作用化学修饰中的问题关键问题酰化及其相关反应烷基化反应氧化和还原反应芳香环取代反应蛋白质肽链的裂解巯基的化学修饰氨基的化学修饰羧基的化学修饰咪唑基的化学修饰酚和脂肪族羟基的化学修饰胍基的化学修饰吲哚基的化学修饰硫醚基的化学修饰二硫键的化学修饰化学修饰反应条件的影响蛋白质化学修饰的定量处理Ray-Koshland方法建立在动力学的基础上，认为在蛋白质的化学修饰反应中，一般情况下，修饰试剂浓度远大于蛋白质的浓度，因此在修饰反应中修饰试剂的浓度变化可以忽略不计，反应均可按伪一级反应处理。这个方法的核心是分别测定蛋白质修饰反应中，基团被修饰的反应速度和蛋白质失活的反应速度。用半对数作图法比较两者反应速度常数，判断必需基团的性质和数目。苯乙二醛也是用来对精氨酸残基进行修饰的，通常是两个分子的苯乙二醛与1个精氨酸残基不可逆地结合，该试剂与?-氨基也有一定的反应性。由于[14C]-苯乙二醛比较容易合成，因此它与蛋白分子的结合就很容易跟踪。有人发现苯乙二醛与精氨酸模型化合物的反应在碳酸氢盐缓冲液中反应较快，并且在该条件下与?-氨基不发生反应。一般认为，与带负电荷的底物或辅助因子作用的酶分子在它的结合位点上通常都含有带正电的精氨酸残基。用苯乙二醛、丁二酮和环己二酮修饰蛋白质分子的结果都证实了这一假说。用这些试剂修饰卵转铁蛋白和人血清转铁蛋白的精氨酸残基的结果表明，在每一个铁原子的结合位点都有1个必需的精氨酸残基。由于色氨酸的反应性要比一些亲核基团如巯基和氨基差，而且色氨酸残基一般是位于蛋白质分子的内部，所以色氨酸残基不与通常使用的一些试剂反应。但色氨酸吲哚基可以与一些试剂发生取代反应或者被氧化裂解。光氧化反应一种常用的修饰色氨酸残基的试剂是N—溴代琥珀酰亚胺(NBS)，可以使吲哚基团氧化成羟吲哚衍生物，反应可以通过280nm处光吸收的减少而进行监测。但是酪氨酸残基也可与该修饰试剂发生反应，并且干扰光吸收的测定。Koshland试剂：2-羟基-5-硝基苄溴(HNBB)作为色氨酸残基的修饰试剂。该试剂可以与色氨酸残基反应生成具有光吸收性的羟基硝基苯衍生物，并且光吸收对微环境的变化很敏感。但值得注意的是Koshland试剂不仅可以与色氨酸残基作用，而且也很容易与半胱氨酸巯基作用，而且两者的吸收光谱相似，因此在修饰色氨酸残基时应对巯基进行可逆保护。HNBB的水溶性较差，有时使修饰反应较难进行。最近发展起来一种溶解性较好的试剂是二甲基(-2-羟基-5-硝基苄基)溴化锍(dimethyl-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)sulfoniumbromide)。这个试剂与2-羟基-5-硝基苄溴的作用相同，在蛋白质色氨酸残基上引入1个HNB基团，因此也称为Koshland试剂II。不同之处它是一种锍盐，易溶于水，有利于试剂与蛋白质分子的作用。当肌酸激酶用连四硫酸钠将巯基氧化保护起来，然后用二甲基(-2-羟基-5-硝基苄基)溴化锍处理保护后的肌酸激酶，在色氨酸残基被修饰后，分离掉过量的未反应试剂，再用DTT将SH重新还原出来。4-硝基苯基硫氯也可用来修饰吲哚基。近来，4-硝基苯基硫氯的类似物异双功能反应试剂2-硝基-4-叠氮苯基硫氯被用来修饰色氨酸残基，可以在胰高血糖素的单个色氨酸残基上附加一个光反应性的叠氮硝基苯基团。胰高血糖素不含半胱氨酸残基，只有色氨酸残基被修饰。蛋氨酸残基的化学修饰主要是由于硫醚的硫原子的亲核性所引起的，尽管该残基的极性较弱。在温和的条件下，很难选择性地修饰蛋氨酸残基，但可以用几种试剂氧化使蛋氨酸成为蛋氨酸亚砜，更多剧烈的氧化剂使它氧化成砜。由于在氨基酸分析中亚砜在酸水解过程中通常会生成甲硫氨酸，因此很容易被忽略掉。在中性和弱碱性的条件下，N-氯琥珀酰亚胺(NCS)和N-氯-p-甲苯磺酰胺(氯胺-T)可以使蛋白质和肽段中的甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜。氯胺-T的选择性要比NCS好，NCS与色氨酸残基反应，而氯胺-T则不与色氨酸残基发生作用，但是两者都与半胱氨酸残基反应。甲硫氨酸残基修饰的另外一种办法是通过卤化烷基酰胺使甲硫氨酸残基烷基化，如用碘乙酰胺进行修饰。由于硫原子在一定强度的酸性溶液中(如pH约为2)处于非质子状态，因此甲硫氨酸残基可以在pH小于4的情况下被选择性地烷基化。同巯基基团类似，二硫键具有其特性可以用来进行特异的修饰，通常是通过还原的方法。这些方法通常与某些巯基修饰方法相结合以阻止再氧化成二硫键或计算断裂开的二硫键的数目。用巯基乙醇将二硫键还原成游离巯基是一种很常用的方法，具有高度的选择性和长的半衰期。为使二硫键充分还原，反应应该在有变性剂的存在下进行，并且由于反应的平衡常数接近于1，必须使用大大过量的巯