CN112891633B 一种基于生物3d打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法 （华中科技大学同济医学院附属协和医院）.docxVIP

(19)国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号CN112891633B(45)授权公告日2022.10.11

(21)申请号202110111703.1

(22)申请日2021.01.27

(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号CN112891633A

(43)申请公布日2021.06.04

(73)专利权人华中科技大学同济医学院附属协和医院

地址430022湖北省武汉市江汉区解放大

道1277号

(72)发明人牟珊汪振星孙家明周莹芊

郭亚琪锁丽涛陈雳风周牧冉

刘绍恺罗超曾宇阳方慧敏慈海侯金飞谢昕芳孙谛

张郭刘剑王冰倩倪若飘

王斌陈佳龙李志鹏姜文彬

揭君津赵阳

(74)专利代理机构武汉楚天专利事务所42113专利代理师邹舟

(51)Int.CI.

C12N5/071(2010.01)

A61L27/40(2006.01)

A61L27/02(2006.01)

A61L27/22(2006.01)

A61L27/20(2006.01)

A61L27/18(2006.01)

A61L27/38(2006.01)

A61L27/50(2006.01)

B33Y70/10(2020.01)

B33Y80/00(2015.01)

审查员唐敏健

权利要求书1页说明书4页附图3页

(54)发明名称

一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法

(57)摘要

CN112891633B本发明提供一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，利用同轴式生物3D打印，以氯化钙溶液作为内层，将甲基丙烯酸酐化明胶，海藻酸钠，聚乙二醇二丙烯酸酯及血管平滑肌细胞混合作为外层生物墨水，打印出的支架通过氯化钙和蓝外光照进行彻底交联，最后形成三位一体化可灌流支架，从而建立血运。在支架内灌注血管内皮细胞，模拟血管细胞成分。在三层支架上分别接种成纤维细胞，脂肪间充质干细胞，骨骼肌成肌细胞，分别加入成纤维细胞培养基，成脂诱导培养基及成肌细胞培养基并放置于反应器中进行培养，将三层支架进行折叠，通过鼠尾胶原进行粘接，形成堆叠式支架。本发明实

CN112891633B

血管平滑肌细胞

血管平滑肌细胞(VSMC)+水凝胶

成纤维细胞(真皮)

脂防维胞(反下组织)

独立的一体化灌注培养

折叠组装

皮瓣模拟支架

骨他机细跑(肌肉)

CN112891633B权利要求书1/1页

2

1.一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)以氯化钙溶液作为内层，将甲基丙烯酸酐化明胶，海藻酸钠，聚乙二醇二丙烯酸酯、光引发剂LAP及血管平滑肌细胞混合作为外层生物墨水，设计串联的三个支架，利用生物3D打印机进行同轴打印；

(2)将步骤(1)打印出的支架通过氯化钙和蓝光光照进行彻底交联，最后形成三位一体化可灌流支架，从而建立血运，在支架内灌注血管内皮细胞，模拟血管细胞成分；

(3)在支架的第一层管网结构上滴加0.5-1mL成纤维细胞悬液，在第二层管网结构上滴加0.5-1mL脂肪干细胞悬液，在第三层管网结构上滴加0.5-1mL骨骼肌成肌细胞悬液，再将打印的支架连接生物反应器，三个反应仓分别加入低糖完全培养基进行培养；

(4)经过低糖完全培养基培养3-5天后，第二个反应仓中更换为成脂诱导培养液，第三个反应仓内更换为骨骼肌诱导分化培养液，培养7-10天后将支架进行折叠拼装，三个支架间利用鼠尾胶原进行粘连固定，继续动态培养7-10天，以促进三层融合，得到立体血管化肌皮瓣。

2.根据权利要求1所述的基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于：所述步骤(1)中外层生物墨水的制备步骤如下：按照质量体积比将5%-8%甲基丙烯酸酐化明胶，1-3%海藻酸钠，10-15%聚乙二醇二丙烯酸酯和0.05-0.1%光引发剂LAP溶解在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，再加入血管平滑肌细胞，使细胞浓度为5×10?-10?个/mL。

3.根据权利要求2所述的基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于：所述外层生物墨水制备好后储存在37℃直到使用。

4.根据权利要求1所述的基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其