抗肝癌单链抗体的体外亲和力成熟研究.docVIP

抗肝癌单链抗体的体外亲和力成熟研究 摘要 第一部分 抗肝癌噬菌体单链抗体突变库的构建和筛选 目的：体外模拟抗体体内成熟过程，构建抗肝癌噬菌体单链抗体突变库，并从中筛选出与肝癌细胞特异性结合的单链抗体。 方法：采用错配PCR和DNA改组技术依次对原始抗肝癌单链抗体A4-16重链可变区和轻链可变区分别进行突变构建抗肝癌噬菌体单链抗体突变库；利用噬菌体展示技术对突变库进行4轮富集筛淘及ELISA鉴定；以ELISAM1、M2、M3、M4M1、M2、M3、M4PCR结合DNAM1、M2、M3、M4A4-16同样具有良好的抗原结合特异性。 关键词：肝癌；单链抗体；错配PCR；DNAM1、M2、M3、M4与原始克隆A4-16DM的亲和力进行初步评价。 方法：以硫氰酸盐洗脱法测定4株阳性克隆M1、M2、M3、M4和原始克隆A4-16ELISA法测定突变体的特异性和硫氰酸盐洗脱法测定其噬菌体抗体的相对亲和力。 结果： 4株阳性克隆相对亲和力指数均高于原始克隆A4-16，分别为：M1 1.5mol/L、M2 1.9mol/L、M3 1.4mol/L、M4 1.6mol/LA4-16 0.8mol/L，按亲和力大小排序为：M2 M4 M1 M3，阳性克隆的相对亲和力分别为原始克隆A4-16的1.9、2.4、1.8、2.0倍；根据氨基酸序列分析发现，M1有3个氨基酸发生改变、M2有个氨基酸发生改变、M3有3个氨基酸发生改变、M4有3个氨基酸发生改变，其中只有以下4个氨基酸突变发生在阳性克隆的重链或轻链CDR区，分别是：Phe31→Ser31、Arg106→Leu106、Ile165→Thr165、Trp226→Arg226，推测这4个CDR区的氨基酸突变与亲和力的改变有关；基因序列分析证实，经定点突变获得的新突变体DM的氨基酸序列中包含了上述4个CDR区的氨基酸突变；突变体DM不仅具有较高的特异性，而且其相对亲和力为原始克隆A4-16的3.9倍，相对亲和力指数为3.3 mol/L。 结论：（1）硫氰酸盐洗脱法是一种简便可靠的测定噬菌体抗体相对亲和力的方法；（2）将影响亲和力的CDR区突变进行组合后获得了亲和力更高的新突变体。 关键词：肝癌；噬菌体抗体；硫氰酸盐洗脱法；定点突变 第三部分 抗肝癌可溶性单链抗体的表达和亲和力常数测定 目的：评价阳性克隆M1、M2、M3、M4及突变体DM的亲和力常数大小。方法： 以ITPG诱导大肠杆菌HB2151表达可溶性单链抗体；利用HiTrap Anti-E Tag亲和层析柱对阳性克隆M1、M2、M3、M4及突变体DM、原始克隆A4-16表达的单链抗体进行纯化；纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以Bradford检测法测定其浓度、ELISA法检测其生物活性；采用非竞争酶免疫法测定上述纯化的单链抗体亲和力常数。 结果：阳性克隆M1、M2、M3、M4及突变体DM、原始克隆A4-16表达的可溶性单链抗体以亲和层析纯化后，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析均可见单一蛋白条带出现，分子量约为32Da；纯化的单链抗体浓度分别为：M1 15g/ml、M2 25g/ml、M3 16g/ml、M4 13g/ml、DM 18g/ml、A4-16 15g/ml；纯化的单链抗体与抗原结合效价分别为：M1 1:32、M2 1:64、M3 1:32、M4 1:32、DM 1:64、A4-16 1:32M1、M2、M3、M4DM的亲和力常数均高于原始克隆A4-16，分别为：M1 6.92×106mol/L-1、M2 9.42×106mol/L-1、M3 6.85×106mol/L-1、M4 7.56× 106mol/L-1、DM 2.44×107mol/L-1、A4-16 DM M2 M4 M1 M3，克隆M1、M2、M3、M4、DMA4-16的 1.9、2.6、1.9、2.1及6.8倍。 结论：（1）经亲和层析纯化后均能获得纯度较高的抗肝癌单链抗体；（2）原始克隆A4-16经过体外亲和力成熟改造后获得了高亲和力的抗肝癌单链抗体突变株M1、M2、M3、M4及DM。 mimicking affinity maturation in vitro. Methods: A single-chain Fv antibody (scFv) mutant library for HCC was established after the heavy chain and light chain of the primitive scFv A4-16 for HCC were mutated by using error-prone PCR and DNA shuffling. Hepatoma cell-specific scFvs wer