平滑肌肌球蛋白轻链激酶N端删除载体的构建.pdfVIP

现代生物医学进展 唧w．biomed．net．cn ProgressinModernBiomediciIIe 2009 Vo1．9 No．19 ·3625 · 平滑肌肌球蛋白轻链激酶N端删除载体的构建 ：tc 吕广艳 崔 颖 于守鹏 陈海波 曲淑贤 高船舟 高 颖 1,2Zk (1辽宁省医学细胞分子生物学重点实验室 辽宁大连 116044；2大连医科大学生化教研室 辽宁大连 116044) 摘要 目的：构建重组平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinase，MLCK)N端删除载体，为研究平滑肌MLCK的分子机 制提供研究模型。方法：以重组质粒pCold／155为模板，根据其待删除序列(N端 1-41个氨基酸)设计上下游引物，行PCR扩增。将 扩增片段以NdeIE／coRI双酶切，产物行琼脂糖凝胶电泳回收得到 目的基因。将 目的基因与载体连接，转化至大肠杆菌。筛选阳性 克隆，并对阳性克隆进行测序。结果 ：用NdeI和EcoRI双酶切重组质粒pCold／155，琼脂糖凝胶 电泳显示得到约4．4kb载体和约 3．4kb的MLCK片段。阳性克隆经测序证实MLCK的N端 41个氨基酸序列已被成功删除。结论 ：成功构建了重组MLCKN端 删除载体 pCold／155／D41。 关键词 ：肌球蛋白轻链激酶 ；肌动蛋白；重组载体 中图分类号：Q75，Q78 文献标识码：A 文章编号：1673—6273(2009)19—3625—04 ConstructionofRecombinantVectorofN—terminusDeleted SmoothMuscleMyosinLightChainKinase* LVGuang-yan~,CUIYing,YUShou-penf,CHENHai-bo1,QUShu-xian~,GAOChuan-zhou~,GAOYing flKeyLaboratoryofM edicalCellularandMolecularBiology,Dalian116044,China； 2DepartmentofBiochemisayandMolecularBioloyg,DalianMedicalUniversRy,Dalian116044,China) ABSTRACTObjective：ToconstructtherecombinantvectoroftheN-terminusdeletedsmoothmusclemyosinlightchainkinase (MLCK)，andstudythemolecularmechanismofMLCKfurthemrore．Methods：Wedesignedforwardprimerlandreverseprimer2based onthesequenceofpColdI／BovineStomach155KMLCK (pCold／155)，andexploredhtePCRtechniquetodeletetheN—temrinus1-41 aminoacid ofMLCK．ThePCR productsweredigestedwithrestrictionendonucleasesNdeUEcoR I．W eretrievedtargetgeneby agarosegelelectrophoresisandligatedthetargetgeneandvectorfragmentbyTaKaRaDNA ligationkitandthentransformedhte recombinantvectorinE．coli．Thepositivecolonieswerepickedoutandsequenced．Results：Weobtained也evector f4．4kb)andthe N．terminusdeletedMLCKframg ents(3．4kb)aftertherecombinantplasmidpCold／155weredigestedwithrestrictionendonucleasesNde FEcoRI．Conclusions：TherecombinantvectorsoftheN．terminusdeletedMLCK(pCold／155／D41)areconstructedsuccessuflly． K