绿色荧光蛋白在细胞标记及活体示踪领域的应用.pdfVIP

中山大学研究生学刊 (自然科学、医学版) 第31卷第2期 JOURNALOFTHEGRADUATES VOL31No2 2010 SUNYAT·SENUNIVERSITY (NATURALSCIENCES、MEDICINE) 2010 绿色荧光蛋 白在细胞标记及 活体示踪领域的应用 陈子秋 ，郭伟韬 (广东医学院2008级在读硕士研究生 524023 广东医学院附属医院骨外科 524001) 【内容提要】随着生命医学研究的不断深入，在微观世界探讨个体细胞的生 理功能以及在人体 内环境 中观察和研究 目的细胞与其他细胞 间的相互作用时， 就离不开细胞标记和活体示踪技术。而在众多细胞标记方法中，绿色荧光蛋 白 (GFP)凭借其标记细胞效率高，标记强度野强、示踪灵敏度高等优点近年来 已经成为越来越多的科研工作者的首选细胞标记和示踪方法。现就绿色荧光蛋 白在细胞标记及活体示踪领域的应用作一综述。 【关键词】绿色荧光蛋白；细胞标记；活体示踪 绿色荧光蛋 白 (greenfluorescentprotein，GFP)是一种报告基因 (reportergene)¨， 所谓的报告基因是一种编码可被检测的蛋 白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产 物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因， 或与其它 目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定 目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 1 绿色荧光蛋白的标记原理及优点 GFP是Morse_2等在研究源于西北太平洋海域的发光水母 (Aequoreavictoria)萤光 现象时首先报道的。其后 Shimomura-3和War等 相继对 GFP的结构和功能进行了较详 尽的研究，证实它是一种功能独特的蛋 白质，编码 238个氨基酸残基，分子量为 2688Da。该蛋白受到紫外或蓝光激发时可以自身催化形成发色结构并发出绿色荧光，其 吸收波长为395nm ，发射波长为509nm 】，从而可以被多种方法检测。绿色荧光蛋白受 光激发产生荧光是一个特异性的独立过程 。在异源细胞 内融合表达后可 自发环化成熟， 自发产生荧光且对异源细胞 内的生理过程无干扰，因此可应用于活体细胞的实时检 收稿 日期 ：2010一O5—28 作者简介：陈子秋，男，1984年生，广东医学院附属医院08级骨外科硕士研究生，主攻方向 脊髓损伤 的干细胞移植 ；E—m8=il：chenziqiu@qq．con 中山大学研究生学刊 (自然科学、医学版) 二。一。年第二期 测 引。同时该报告基因检测不需要底物，基因产物一绿荧光蛋 白在加热、变性剂、去 垢剂及一般的蛋 白酶均不能使它灭活。另外，该蛋白的可用荧光显微镜或荧光激活的细 胞分类系统 (FACS)进行检测，该报告基因还有一重要优点即能在活细胞条件下观 测，而且能进行细胞内的定位分析。 2 绿色荧光蛋 白的改 良及改 良后的新特点 对真核基因的调控的了解，主要来 自野生型和突变型的假定顺式作用调控元件的活 性测定实验，这些实验是在转染的真核细胞中进行的。而野生型的GFP无放大作用， 故比荧光素酶的灵敏度低。但 目前很多研究机构和试剂公司将野生型的GFP进行基因 工程改造，使其荧光更亮、能发出不同颜色的荧光以及可表达在细胞的不同部位。例 如：CPG公司的AFP—TagMTvectors是一种能与插入 的目的基因产生融合蛋 白的标记载 体，它能发出蓝、绿色荧光。Qbiogene公司的SuperGloM。GFP与SuperGloBFP证明提高 激发光的峰值，使其发射光谱用荧光共振能量转移技术 (fluorescenceresonanceenergy transfer，FRET)进行活细胞内的荧光的观察。BDBiosciences—CLON —TECH公司的 构建了一种报告基因质粒 (LivingColorsMTFluorescentTimer)，在插人的目的启动子随 着时间而失活时，其颜色也由绿色变为