鸡白细胞介素18成熟蛋白的原核表达及抗体间接ELISA方法的建立.pdfVIP

山东 农 业 科 学 2012，44(4)：5—9 ShandongAgriculturalSciences 鸡 白细胞介素 18成熟蛋白的原核表达 及抗体间接 ELISA方法的建立 苏倩倩，李恩扩，张海滨，周 霞，胡敬东 (山东农业大学动物医学院／山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室，山东 泰安 271018) 摘 要 ：将鸡自细胞介素 18的成熟蛋白(chickeninterleukin18matureprotein，mChlL一18)基因在原核系 统表达。采用Ni—NTA亲和层析方法纯化得到该重组蛋白。纯化后重组蛋白包被反应板 ，通过方阵滴定确定 最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、羊抗 鼠酶标二抗稀释倍数 ，建立检测 ChIL—l8成熟蛋白抗体的间接 ELISA方法。经方阵滴定结果确定最佳抗原包被质量浓度为4 ／rI1l，阳性血清稀释 比例为 1：10，羊抗鼠 IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释比例为1：12000，抗原抗体最佳结合时间是 1．5h，血清与二抗最适反 应时间为 1h。阴性、阳性血清的判定标准为 ：被检样本的OD值是一组阴性样本OD值的2或3倍且 OD45o≥ 0．5，即为阳性，比值以P／N表示，1．5WN2．0为可疑，WN1．5为阴性。本试验结果证明该方法具有良 好的稳定性、重复性和特异性，为下一步单抗的筛选鉴定奠定了必要的基础。 关键词：鸡 白细胞介索18成熟蛋白(mChIL一18)；原核表达；蛋白纯化；间接 ELISA 中圈分类号：Q503 文献标识号：A 文章编号：1001—4942(2012)04—0005—05 ProkaryoticExpressionofChickenIL一18MatureProteinGeneand EstablishmentofIndirectELISA f0r、Serum AntibodyDetection SUQian—qian，LIEn—kuo，ZHANGHai—bin，ZHOUXia，HUJing—dong’ ． ()CollegeofVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity／ShandongProvincialKeyLaboratoryof AnimalBiotechnalogyandDiseaseControlandPrevention，Taian271018，China Akaraet Thegeneofchickeninterleukin18matureproteinwasexpressedinprokaryoticsystem．The recombinantmChIL一18proteinwaspurifiedbyNi—NTAResinaffinitychromatography．’nleindirectELISA fordetectingmChIL—-18proteinantibodywasestablishedtodeterminetheimmunogenicityoftherecomb inant protein．Theoptimum workingconditionsfortheELISAwereasfollows：optimal concentrationofmChIL一18 ofrcoatingwas4 v．／ml；htedilutionratioofserum samplewas1：104；theoptimal coatingconditionof mChIL一18forEUSAwasincubatedat37℃ for2hoursandthenat4~C overnight；htebestdilutionratioof HRP—lbaeledgoatnati—mouseIgGwas1：12000；thebestincubationtimeofrtheresponseofserum sample witllhtemChIL一18proteinandHRP—labeledgoatanti—mouseIgGwere1．5hours andlhrespectivelyat 37oI=．Theasse