人血管内皮生长因子165慢病毒载体的构建及其抗放射所致细胞凋亡的作用.pdfVIP

第32卷 第5期 中山大学学报 (医学科学版) Vo1．32 No．5 2011年 9月 JOURNALOFSUNYAT·SENUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES) Sep． 20l1 人血管内皮生长因子 165慢病毒载体的构建及 其抗放射所致细胞凋亡的作用 赵仲艳 ，韦映梅 ，黎祥喷，吕瑞妍，肖颂华，刘中霖，邢诒刚，刘 军 (中山大学孙逸仙纪念医院神经科老年神经变性专科，广东 广州510120) 摘 要：【目的】构建人血管内皮生长因子 165(hVEGF。)慢病毒表达载体 pCDH—CMV—MCS—EF1一copGFPhVEGF。，并转 染至HT22细胞，并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】PCR扩增hVEGF 基因，克隆到pCDH— CMV—MCS—EF1一copGFP载体；通过酶切电泳，菌落PCR初步筛选和测序鉴定构建的pCDH—CMV—MCS—EF—GFP1一hVEGF。重组 载体：采用磷酸钙共转染法转染 293T细胞包装制备慢病毒液，并感染 HT22细胞，采用实时RT—PCR及WesternBlot检测 hVEGF。65基因在HT22细胞中的表达情况。进一步对单纯HT22细胞、空质粒转染组以及hVEGF 转染组 HT22细胞进行 0、 5、1OGy的x线照射，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】hVEGF 基因片段重组到pCDH．CMV—MCS—EF1一copGFP载体， 酶切后电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段 ，测序结果与GenBank序列完全一致，转染 HT22后 KVEGFmRNA及 蛋 白表达水平明显增高。而且同各对照组相 比，hVEGF。可以降低细胞放疗后的凋亡率。 【结论】pCDH—CMV．MCS．EF1 copGFP．hVEGF 慢病毒表达载体构建成功 ，其转染HT22细胞后可获得高水平 hVEGF65mRNA和蛋白的表达，hVEGF 具 有抗放射所致细胞凋亡的作用。 关键词：人血管内皮细胞生长因子；慢病毒；载体构建 ；HT22细胞；放射治疗 中图分类号：R747．9 文献标志码 ：A 文章编号：1672—3554(2011)05—0576—06 ConstructionofLentivirusVectorofhVEGF165GeneandItsProtectiveFunctionof Irradiation-inducedApoptosis ZHAOZhong-yan，WEIYing-mei，LIXiang．pen，曲 Rui．yan，XIAOSong．hua，LIUZhong．1in， XINGYi—gang，LIUJun (DepartmentofNeurology，SunYat-senMemorialHospitalofSunrat-senUniversity，Guangzhou510120，China) Abstract：O【bjective】Toconstructhumanvascularendothelialgrowthfactor一165(hVEGFl65)genelentivirusexpressionvector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-hVEGF165， anddetectitsexpressionaftertransfectedintoHT22cellsandfurtherobserveitseffectof anti—apopotosisinducedbyirradiation．M【ethods】hVEGFl65genecDNAwasamplicatedbypolymerasechainreaction(PCR)and clonedintothepCDHCMVMCSEFvector．ReconstructedpCDH—CMV-MCS—EF1一hVEGFl65plasmidwasidentifiedbyelectromigratory analysis， colonyPCR， and seq