膀胱癌患者尿脱落细胞抑制消减文库的构建及差异基因的初步筛选.pdfVIP

国际泌尿系统杂志 2009年3月第 29卷第2期 InternationalJournalofUrologyandNephrology，Mar2009，Vo1．29NO．2 163 · 论 著 · 膀胱癌患者尿脱落细胞抑制消减文库 的构建及差异基因的初步筛选 张冲 郭柏鸿 张志华 史葆光 车团结 陈一戎 【摘要】 目的 应用抑制性消减杂交方法筛选膀胱移行细胞癌患者与正常人尿脱落细胞差异表 达基因。方法 分离膀胱移行细胞癌患者与正常人尿液中总 mRNA，用 SMART技术反转录成 cDNA，经过酶 切 、接头连接 、两轮消减杂交及两轮抑制性 PCR，使得差异表达的DNA片段得以富集。PCR产物与T／A载 体连接并转化大肠杆菌XL—blue构建差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后随机挑取克隆进行酶 切 、测序及同源性分析。结果 PCR鉴定有 317个克隆载有主要在 200～900bp之间呈随机分布的插入片 段，片段插入率达93．2％，证实建库成功。对2o个质粒测序结果经同源性比对分析，其中20个片段源于 l7 个已知基因，1个克隆在GenBank中未检索到与其有相似性的基因序列，表明它们可能为BTCC差异表达的 新基因。结论 该消减杂交文库质量可靠，它的成功构建为进一步筛选、克隆膀胱肿瘤差异表达基因提供了 依据，也为膀胱肿瘤诊断基因芯片的研究与开发奠定了基础。 【关键词】 膀胱肿瘤；基因 Screeningdifferentiallyexpressedgenesofurineexfoliatedurothelialcellsintransitional cellcarcinomabySSH ZhangChong，GuoBai—hong，ZhangZhi—hua，eta1．DepartmentofUrology，People’SHospitalofGansuProv— ince，Lanzhou，China，730000 Abstract Dbjectives ToScreeningtransitionaldifferentiallysuppressionsubtraetivecDNAlibraryin transiti0nalcellcarcinomaofbladder(BTCC)andn0珊alurineexfoliatedurothelialcells．Methods TotalmRNA wasisolatedfrom BTCC andnormalexofliatedurothelialcellsinurine，respectively．Thendouble—strandcDNA was synthesizedandrestrictedbyHaem ．cDNAofBTCCwasdividedintotwogroupsandligatedwitheitheradaptor1or adaptor2．AfterhybridizedtwicenormalexfoliatedumthelialcellscDNA underwentnestedPCR，thePCR products wereclonedintoPGM —TvectorandtransfomredtoE．coilJM109．Somepositivecloneswererandomlypickedup， digested，sequencedandhomologousanalyzed．Results TheSSHlibrarycontainedabout400positiveclones． Random analysisof384cloneswithenzymerestrictionshowedthat317clonescontainedcDNA rfagmentswhichwere mainlybetween200—900bp．Th einsertedratereachedto82．6％ ．A subtractedcDNA libraryofdifferentiallvex- pressedgenesWa$successfullyconstructed withSSH．Among20rabitrarycloneswerederived from theabove3l7 clones，No．243cloneisapreviouslyunknownsequenceandtheother17