四川兽类新纪录——秦岭鼢鼠线粒体Cyt b基因的克隆及其比较研究.pdfVIP

第30卷 第 1期 西 华 师 范 大 学 学 报 (自然 科 学 版 ) 2009年3月 Vo1．30 No．1 JournalofChinaWestNormalUniversity(NaturalSciences) Mar．2009 文章编号：1673—5072(2009)0l一0008-05 四川兽类新纪录——秦岭鼢鼠 线粒体 Cytb基因的克隆及其比较研究 何 娅 ，周材权，潘 立 (西华师范大学珍稀动植物研究所 ，四川 南充 637009) 摘 要：为揭示2003年在王朗采集的鼢鼠标本王03001号是否为秦岭鼢鼠I~IJII兽类新纪录，以鼢鼠标本王0300 号的肌肉组织为研究材料 ，运用 PCR技术对其线粒体 Cytb基 因进行克隆和测序．结果表明该基 因的长度为 1140bp，编码 380个氨基酸 的蛋 白质 ，所编码 的蛋 白质含有2个 N一糖基化位点，1个蛋 白激酶 C磷酸化位点，4个酪 蛋 白激酶 Ⅱ磷酸化位点，6个 N一豆蔻化位点．再以已研究的鼢鼠6个种 18个体Cytb基因序列及氨基酸序列为基础 数据 ，把 中华竹 鼠(Rhomyssinensis)作为外群 ，结合本研究的结果构建系统发育树 ，所得结果不支持王 03001号标 本为秦岭鼢 鼠． 关键词 ：秦岭鼢鼠；Cytb基因；克隆；比较研究 中图分类号：Q959．4 文献标识码 ：A 秦岭鼢鼠(Eospalaxrll,fe$cen~)分布于陕西秦岭，宁夏六盘山南部，与六盘山毗邻的甘肃地区…．1998年9 月 15日及2003年9月 l1日，周材权等于王朗 自然保护 区大窝凼等地采集到一批鼢鼠标本，随机抽取 4号 标本进行测量和鉴定 ，确认为四川省尚未正式记录过的秦岭鼢鼠 ．本文以该标本的肌肉组织为研究材料 ， 对其线粒体体细胞色素b(Cytb)基因进行克隆和测序 ，旨在从分子水平上为其系统分类地位寻找证据． 动物线粒体基因组是呈母系遗传 ，因其分子量小、进化速度快 等特性而被广泛地用于系统发育研究． 线粒体基因组上的细胞色素b(Cytochromeb，Cytb)基 因的进化速度适 中，一个较小的基 因片段可包含从 种内到种问乃至到科间的进化遗传信息 ，在系统进化和分类研究中具有很好的适用性 儿 ．本研究以王 03001号标本作为研究材料，提取肌肉组织中线粒体基因组 DNA，运用 PCR技术对 Cytb基因进行扩增、克 隆、测序及其比较研究，探讨王朗国家 自然保护区中鼢鼠标本王03001号在鼢鼠亚科中的分类地位． 1 材料，方法与资料 1．1 材 料 王朗 自然保护区的鼢鼠标本 ，标本号为王03001(该标本保存在西华师范大学珍稀动植物研究所标本 馆)，取其肌肉，95％的乙醇固定．取 0．5g的鼢鼠肌 肉于 EP管 中． 1．2 方 法 1．2．1 总 DNA的提取 将 EP管中的肌肉组织用双蒸水冲洗3次，剪碎 ，加入消化缓冲液．缓冲液组成 ：400txLTE(pH=8．0)， 100~L的EDTA(0．5M)，100~L10％SDS，501xL的NaC1(5M)，20lxL蛋白酶 K(20mg／mL)，55~C水浴 12h．取 收稿 日期 ：2008—12—10 基金项 目：国家自然科学基金资助项 目 作者简介 ：何 娅 (1982一)，女，四川 巴中人，西华师范大学珍稀动植物研究所硕士研究生 ，主要从事分子生态学研究． 通讯作者 ：周材权 (1968一)，男，四川安岳人，西华师范大学生命科学学院教授 ，博士，主要从事动物生态学与保护生物学 研究工作． 第30卷第 1期 何 娅，等：四川兽类新纪录——秦岭鼢鼠线粒体Cytb基因的克隆及其比较研究 9 出EP管，4000r／min离心5min，取上清液600 L于一新的EP管中，常规的苯酚．氯仿抽提，乙醇沉淀DNA． 1．2．2 线粒体上 Cytb基 因的PCR扩增 扩增引物 ：L14724(5’．CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG．3’)，H15917 (5’．CGGAAIvI’CCATTTTTG． GTTTACAAG-3’) ．反应体系：30p~L，10×PCRbu