周期蛋白D1正反义表达质粒的构建鉴定及其对哮喘大鼠气道平滑肌增殖的影响.pdfVIP

维普资讯 药学学报 ActaPharmaceuticaSinica2008，43(3)：247—252 ·247· · 研 究 论 文 · 周期蛋 白D1正反义表达质粒的构建鉴定及其 对哮喘大鼠气道平滑肌增殖的影响 乔礼芬，徐永健 ，刘先胜 ，谢俊刚，杜春玲 ，张 建 ，倪 望，陈士新 (华 中科技大学 同济医学院 附属同济医院 呼吸 内科 ，湖北 武汉 430030) 摘要：观察哮喘大 鼠气道平滑肌周期蛋 白D1的表达，并构建大 鼠周期蛋 白Dl(CyclinD1)正反义表达质粒 ，转 染支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞 (ASMC)，探讨 CyclinD1在哮喘大 鼠ASMC增殖过程中的影响。大 鼠雾化吸入卵 清蛋 白建立哮喘模型，免疫荧光检测 CyclinD!的表达 。以气道平滑肌条总 RNA为模板 ，通过 RT—PCR获取大 鼠 CyclinD1全长 cDNA，插入到真核表达载体 pcDNA3．1(+)上 ，构建 CyclinD1正义表达质粒 (pcDNA3．1一CyclinD1)和 反义表达质粒 (pcDNA3．1一asCyclinD1)。用脂质体介导的基 因转染方法 ，将正反义重组体和空质粒 (vector)分别转染 哮喘大 鼠和正常大 鼠ASMC，用 Westernblotting方法鉴定 CyclinD1基 因的表达。采用流式细胞术 、四 甲基偶氮唑盐 (MTT)法、增殖细胞核抗原 (PCNA)染色等方法观察构建质粒对哮喘大鼠ASMC增殖的影响。结果表 明：(1)与对照 组相 比，哮喘组 CyclinD1表达显著增高；(2)酶切鉴定和测序分析证实，试验成功构建 了CyclinD1正反义表达质粒 。 与转染 pcDNA3．1一CyclinD1组和 vector组相 比，转染 pcDNA3．1一asCyclinD1组大 鼠ASMC中CyclinD1表达水平下降 (P0．01)；(3)与 vector组 s+GM期 比例、吸收度(A)值 、PCNA阳性表达率相 比，转染 pcDNA3．1一CyclinD1组增殖 指标均明显增加(P0．01)。转染 pcDNA3．1·asCyclinD1组增殖指标均 明显下降 (P0．01)。正常组大 鼠转染质粒 后各组间变化趋势与哮喘组一致 。pcDNA3．1一CyclinD1可促进哮喘大 鼠ASMC增殖 ，pcDNA3．1·asCyclinD1可抑制哮 喘大 鼠ASMC增殖 ，提示 CyclinD1在哮喘ASMC增殖 的信号转导中具有重要作用 。 关键词 ：CyclinD1；表达载体 ；哮喘；气道平滑肌细胞 ；增殖 中图分类号 ：R963；R363 文献标识码 ：A 文章编号 ：0513—4870(2008)03—0247～06 RecombinationandidentificationofsenseandantisenceCyclinDl eukaryoticexpressionvectorsandtheeffectsofthevectorson theproliferationofairwaysmoothmusclecellin asthmaticrats QIAOLi—fen，XUYong-jian ，LIUXian—sheng，XIEJun—gang，DUChun—ling， ZHANG Jian，NIWang，CHEN Shi—xin (DepartmentofRespiratoryMedicine，TongjiHospitalAffiliatedto MedicalCollege， HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China) Abstract：Thisstudy iSto investigate the expression o