T淋巴细胞检测的常用方法和意义.pptVIP

CD4＋T淋巴细胞检测的常用方法和意义中国疾病预防控制中心肖瑶 专家简介 肖瑶，女 。中国免疫学会临床免疫分会委员，艾滋病检测实验室评审和技术指导专家组秘书。 中国疾病预防控制中心国家艾滋病参比实验室研究员，硕士生导师 淋巴细胞数目有助于评价免疫功能减退的程度和AIDS进程，监控抗逆转录病毒（ARV）治疗、细胞因子治疗和保护治疗性疫苗的疗效 本章介绍了HIV感染人体的过程、检测CD4＋T淋巴细胞计数的方法和引起CD4＋T淋巴细胞数变化的一些影响因素 导言 课程内容 HIV感染过程 HIV感染后CD4＋T淋巴细胞变化 CD4＋T淋巴细胞检测的常用方法 CD4＋T淋巴细胞数的意义和影响因素 一、HIV感染过程 HIV病毒模式图 逆转录病毒科 慢病毒属 灵长类慢病毒群 包膜RNA病毒 直径120nm HIV病毒颗粒: 基因组RNA 外膜蛋白Env 衣壳蛋白Gag 逆转录酶RT 蛋白酶PRO 整合酶IN 复 制 通过gp120蛋白与宿主细胞的 CD4分子结合 HIV的膜与细胞膜相融合 病毒进入细胞 gp41透膜蛋白和辅助受体协助 HIV能结合人类具有CD4+受体的细胞，特别是和 CD4+T辅助淋巴细胞相结合 复 制 RNA 基因组 DNA前病毒 宿主细胞的基因组 成熟的子代病毒 反转录 合成 整合 宿主细胞的作用是什么？ 二、HIV感染后CD4＋T淋巴细胞变化 T淋巴细胞总数减少 Th细胞(CD4+细胞)绝对计数下降 T细胞亚群比例倒置，Th/Ts1.0 Ts细胞增高 NK细胞减少或活力下降 B细胞正常 HIV感染后机体的免疫应答反应 在临床潜伏期， 血液中的HIV浓度维持在一个稳定的低水平(set-point) CD8+T淋巴细胞在感染急性期持续升高, 直到AIDS早期仍保持较高水平 HIV感染急性期CD4＋T淋巴细胞数量轻微降低 出现AIDS时病毒载量，P24抗原浓度达到较高水平而CD4＋T淋巴细胞数量很低 急性期后CD4T细胞可恢复到未感染时80%的水平并逐渐降低 CD8+T淋巴细胞的增高往往伴随着病毒载量的降低, 提示CD8＋T淋巴细胞能控制体内病毒复制, 与感染急性期和临床潜伏期的病毒复制控制有关。 在此期内, CD4＋T淋巴细胞的更新很快, 因而, 被HIV杀伤的CD4＋T淋巴细胞能得到较为有效的补充 随着时间的推移, 免疫系统发生崩溃. 当被HIV杀伤的CD4＋T淋巴细胞得不到补充后即出现AIDS 在HIV感染者中，约有10%可在2~3年内发展到机会性感染频发的阶段，为快速进展者，其外周血中CD4＋T淋巴细胞的数目可在2~3年内急剧下降 另有5%~10%的感染者为长期不进展者，他们在感染7~10年后仍不表现临床症状，而且外周血中的CD4＋T淋巴细胞水平基本保持稳定。这些无进展者体内抗HIV的MHC I 限制性CTL活性、CD8+T细胞抑制活性和中和抗体水平一般都较高，外周血CD4＋T淋巴细胞水平比较稳定 感染者 快速进展者 长期不进展者 三、CD4＋T淋巴细胞检测的常用方法 目前使用的流式细胞仪有 FACSCalibur、FACSCount、CyFlow Count、Guava、FlowCare、Partec等，有些结构简单、外观较小、重量较轻、价格低廉 检测方法： 1.流式细胞仪 多平台法 单平台法 白细胞计数、白细胞中淋巴细胞百分比、淋巴细胞中CD4+T 淋巴细胞百分比。操作步骤复杂、费时费力和误差较大 一步即可得到CD4+T淋巴细胞亚群的相对数（百分比）和绝对数。操作步骤简单、实用、省时和准确 - Cyto-Spheres 和 Dynabeads - 光学显微镜和荧光显微镜 - 小型仪器设备（离心机和磁力架等） - 费用低，适用于基层实验室 - 不适合大批量标本的检测 - 受主观因素影响较大 - 目前国内较少使用 2.手工操作方法 样品要求 样品要求 抗凝血 一般采用48小时内检测 采用CD45圈门可72小时内检测 凝血融血不可检测 流式细胞仪器 MultiTEST四色荧光分析 影响CD4细胞数的因素 1. 季节性和昼夜差异：如每日最低水平在中午12点30分，峰值在下午8点30分（JAIDS，1990，3 :144） 2. 肾上腺皮质激素对CD4细胞数有较大的影响，短期服用可能使CD4从900 /ul下降到300 /ul.Clin immunopath,1983,28:101) 3. 合并感染HTLV-1的病人可能造成CD4的假性升高（Ann Intern Med,1993,119 :55) 4. 急性改变可能由于淋巴细胞在外周循环和骨髓、脾及淋巴结中的再分布(Clin Exp immunol,1990,80:460) 四、CD