维持耐辐射球菌基因组稳定性关键基因recQ功能及调控网络研究.pdf

摘要 耐辐射球菌 Deznococcus radiodurans 是迄今为止发现的对电离辐射、 紫外线，干燥、过氧化氢等一些DNA损伤剂都具有极强抗性的微小球菌，它在DNA 双链断裂修复上具有超强的能力，是目前研究DNA损伤与修复的模式生物。从 1999年Deinococcus radgodurans野生株R1全基因组数据公布以来，该细菌的分 子结构特征研究，分子防御机制方面和重要修复基因，如reeA、sspprl．pprA 等在DNA修复机制方面都取得了很大的进展，但还未能清楚揭示耐辐射球菌的修 复机理。 RecQ解螺旋酶是解螺旋酶在进化中高度保守的一个亚族，它在维持有机体 基因组的稳定性中有重要的作用。耐辐射球菌具有两个特殊结构的RecO家族成 员：DRl289和DR2444，这两个基因在该细菌中的具体功能都未知。本文主要系 统地研究这两个基因在耐辐射球菌中的作用机制和调控网络，具体从以下几个 方面进行了研究： 1．先运用生物信息学的方法确定这两个基因在染色体上的具体位置，对 DRl289和DR2444进行了结构域的同源性分析，功能预测和进化树分析，结果表 明DRl289与细菌及真核生物有较近的亲缘关系，而DR2444相差较远。 2．运用PCR突变三段连接法克隆具有自身groEL启动予、倒珀动子分别与 卡那霉素抗性基因，氯霉素抗性基因融合的DNA片段反向重组到基因组中，构建 并鉴定了卡那霉素抗性完全突变株ADRl289。氯霉素抗性完全突变株ADR2444， 双突变株ArecO。辐射条件下和H：O。氧化压力下突变株生存率结果表明： ADR2444与R1存活率趋势线基本一致，而ADRl289和A期c仞【突变株较为敏感。 根据上述结果推测，DRl289是一个对Rl保持极端抗性的必需基因，而DR2444是 非必需基因。 3．分析了突变株ADRl289的一些特性，表型数据表明，敲除掉DRl289这 砌 个基因后，突变株对Uv，丝裂霉素C，过氧化氢都极敏感，对Y一辐射在超过2kGy 剂量下敏感．△DRl289生长与野生株相比较为缓慢；脉冲场电泳表明，无论在 正常生长状况，还是过氧化氢胁迫条件下，该突变株都具有基因组的不稳定性， mM 尤其是在20 H20。处理30分钟后，其基因组图谱与Rl在高剂量辐射和长期干 燥胁迫下的图谱很相似。运用穿梭质粒pRADK进行DRl289各个结构域的功能性补 偿，表明belicase结构域和3个串联的HRI C结构域都必不可少。 4．用大肠杆菌表达系统体外表达了DRl289各个结构域的突变蛋白，并进行 了纯化。我们使用荧光染料H33258。长度为2．7 kbp的线性化双链 ／／indm- pUCl9 片断作为底物的荧光染色替代法检测解螺旋酶活性。不同ATP和金属离子 浓度下该蛋白的解螺旋酶活性表明，DRl289的解螺旋酶活性至少与曾经报道过 的大肠杆菌的RecQ活性相当。SSB蛋白作为一个解螺旋酶功能促进因子，我们发 现DRl289解螺旋速率能够被ft．radioduransSSB蛋白提商，且对DRl289蛋白有 ATPase 相同物种专一性的特殊效应。ATPase活性表明helicase结构域对DRl289 是必需的，而陬Dc结构域是达到最J舌ATPase酶活性所必需的结构域．基于这些 实验，我们推测在耐辐射球菌中，DRl289的c一末端三个串联的HRDc结构域已经 进化，从而应对各种类型的I NA损伤。 5．在DRl289删除以后，全基因组转录谱水平约有9．1％发生了2倍以上的改 变，如铁离子的代谢，氧化相关基因和细胞分裂相关基因．另外，在20加MHz0。压 blot 变化趋势与野生株在强剂量辐射和长期干燥条件下的趋势很相象。Western 分析表明无论在有氧化胁迫条件，还是在正常生长条件下，突变株中RecA水平 都上升，表明当DRl289删除后，体内确实存在较大的DNA损伤，进一步佐证了芯 片数据。高锰低铁可以促使耐辐射球菌的抗性提高，但ICP-MS测定结果显示 DRl289突变体内全铁含量上升，而全锰含量下降，导致MrI／Fe比例从0．38下降到 0．07．而顺磁共振实验表明突变株中的自由铁量约为野生株的50％．综上所述， DRl289基因是一个维持耐辐射球菌基因组稳定性和贡献于极端抗性的关键基 Ix 因。 6．为了进一步研究耐辐射球菌DRl289蛋白在极端抗性中的调控机制，通过 PF 二维液相色谱ProteomeLab 2D目标蛋白快速分离系统分析了野生株R1与功 能破坏株ADRl289在20棚H20：氧化压力下蛋白表达谱的差异。 综上所述，耐辐射球菌的两个recQ基因中，DR2444是不参与极端抗性的非