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E. coli 木糖代谢途径中木糖异构酶缺失突变株的构建 裴娜，包静，庞思平，高海军* ( 北京理工大学生命科学与技术学院 北京 100081 ) 摘要：为研究木糖代谢途径以及提高以木糖为底物合成代谢产物的效率，对木糖异构酶基因xylA 进行敲除 研究。扩增大肠杆菌DH5α木糖异构酶的部分基因片段xylA ’，构建自杀载体pGPCM-xylA ’，通过自杀载体 pGPCM-xylA ’上的xylA’ 片段和染色体上的xylA 基因之间的同源重组使大肠杆菌DH5α染色体上的xylA 基因 插入失活，为进一步研究木糖的利用打下基础。 关键词：木糖异构酶；自杀载体；同源重组；突变株 Construction of a Mutant E.coli DH5α with Inactivated xylA Na Pei ，Jing Bao ，Siping Pang ，Haijun Gao (Beijing Institute of Technology, Beijing 100081) Abstract: In order to investigate xylose metabolism in E.coli DH5α, a homologous recombination approach was used to construct a xylose isomerase deletion mutant of E. coli XylA ’, a selected fragment of xylose isomerase from E. coli, was successfully amplified by PCR reaction and was cloned into vector pGPCM. The suicide vector pGPCM-xylA ’ was used to delete xylA gene of E. coli DH5α. Key words: xylose isomerase, homologous recombination, suicide vector 引言 木质纤维材料广泛存在于农业、林业以及以农产品、林产品为原料的工业(如造纸业)废 弃物中,是巨大的再生资源。木质纤维素主要成分为纤维素、半纤维素及木质素三部分，其 中木糖是第二大糖类物质,含量可高达35% 以上。由于半纤维素结构及组成的混杂性，且聚 合度较低, 因而降解比纤维素容易得多,采用热或酸解即可使半纤维素降解为单糖或寡糖,因 而对木糖生物转化的研究是充分开发利用半纤维素的基础[1] 。另外，木糖本身可被细菌、酵 母菌和丝状真菌转化为乙醇、木糖醇等产物。乙醇是最有发展前景的液态燃料，清洁便捷的 可再生能源之一；木糖醇由于其天然的甜味特性是理想的新型甜味剂，具有较高的商业价值。 可见，对木糖代谢的研究有着重要的意义。 基因xylA 的产物是木糖异构酶(xylose isomerase ，XI) 。该酶能催化木糖转化为木 酮糖，不需要任何辅助因子，在利用木质纤维素微生物发酵生产乙醇的过程中起着关键 作用；在体外也能催化葡萄糖到果糖的异构化反应[2] ，该反应是工业上大规模以淀粉 制备高果糖浆的关键步骤，故习惯上将木糖异构酶称为葡萄糖异构酶[3] 。由于其重 要的工业应用价值及理论研究意义，近年来国内外对木糖异构酶的性质、结构、基 因工程和蛋白质工程等方面的研究方兴未艾，并取得了很大进展。木糖异构酶作为微 生物利用木糖的关键酶一直受到国内外科研工作者的关注，早期Chan Err Cheng[4]等将E.coli 的xylA基因引入Schizosaccharomyces pombe 中，测得乙醇的最终浓度可达到3.7%，并提出乙 醇产生的限速步骤是木糖到木酮糖的转化。 本研究运用PCR 技术，扩增大肠杆菌DH5α木糖异构酶的部分基因片段xylA ’，构建自 杀载体pGPCM-xylA ’，通过自杀载体pGPCM-xylA ’上的xylA ’片段和染色体上的xylA 基因之 间的同源重组使大肠杆菌DH5α染色体上的xylA 插入失活，筛选获得xylA 缺失突变株，有 望阻断大肠杆菌木糖异构化途径，为研究木糖代谢途径以及提高以木糖为底物合成代谢产物 打下基础。 1 材料与方法 1.1 菌种和质粒 大肠杆菌