人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库的构建及质量分析.pdfVIP

· 1868· 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2011，27(10)：1868—1872 [文章编号] 1000-4718(2011)10—1868—05 人类纤维化心脏瓣膜噬茵体表达文库的 构建及质量分析米 孟锦绣 ， 李运雄 ， 朱 平 ， 卢 聪 ， 郑少忆 ， 余细勇 (广‘东省人民医院／广东省医学科学院医学研究中心，2广东省心血管病研究所，广东 广州 510080) [摘 要] 目的：各种病因引起的心脏瓣膜纤维化是导致心脏瓣膜功能丧失的主要原因，样本来源有限和不 可重获性是其分子机制研究的瓶颈。本研究旨在成功获取患者纤维化瓣膜的遗传信息物质，为探明瓣膜病变的分 子机制提供直接证据。方法：心脏换瓣手术中取纤维化瓣膜组织，提取高质量 RNA，用SMART技术合成cDNA第 1链 ，再用长距离PCR合成双链 cDNA，经 I酶切后过柱分级收集长片段cDNA，经T4DNA连接酶催化连接入 kTriplEx2载体，最后经 噬菌体包装后构建成原始文库 ，用PCR、X—gal等方法进行文库质量鉴定。结果：成功构 建了纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库，原始文库滴度为8×10pfu／L，重组率为99％，外源基因片段大小在 500到 3000bp之间，其中81．25％片段大于1000bp。结论 ：成功构建了高质量的人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库， 该文库的库容量足够代表人类基因的复杂性，高重组率能保障功能筛选的高效性 ，长片段更有助于全长基因的获 得和表达。 [关键词] 心脏瓣膜；纤维化 ；噬菌体文库构建 [中图分类号】 R363 [文献标识码] A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2011．10．003 Constructionandcharacterization ofacDNA library fibroticheartvalves MENGJin—xiu ，LIYun—xiong，ZHUPing ，LUCong ，ZHENGShao—y～l，YUXi— l yong (MedicalResearchCenter，GuangdongGeneralHospital／GuangdongAcademciofMedicalSciences，GuangdongCardiovas— cularlnsthu~，Guangzhou510080，China．E—mail：yuxycn@hotmail．corn) [ABSTRACT] AIM：Toovercomethebottleneckofresearchonmolecularmechanismofvalvefibrosis，whichis limitationandnonrepeatabilityofpatients’valvesamples，acDNA libraryofheartvalvefibrosisattranscriptionlevelwas constructedintophagelibrarytostorethegeneticmateria1．METHODS：Freshfibroticvalvetissueswerecollectedincure surgerynadhigh—qualityRNA Was isolated．Thefirst—s~andcDNA wassynthesizedbyRT—PCR ofSMART technique andthedouble—strandcDNAwasconstructedbylongPCR．cDNAwasdigestedbysfiInadfractionated．andhtenligated tokTriplEx2vector．Finally．theproductionWas ~llowedby phagepackagingreaction．Thequalitiesofbohtunamplified cDNA librarieswere strictlycheckedbytiterdetermination，PC